A leucemia mielóide crônica (LMC) é uma doença mieloproliferativa resultante da expansão clonal da célula hematopoética precursora. Sua fisiopatologia está associada ao cromossomo (cr) Philadelphia (Ph) originado da t(9;22) e ao oncogene bcr-abl1 que codifica a proteína Bcr-Abl1 com constitutiva atividade de tirosinoquinase (TK). A expressão de Bcr-Abl determina a leucemogênese por meio da alteração da adesão das células progenitoras leucêmicas ao estroma medular e resistência à apoptose. Os inibidores de TK, o mesilato de imatinibe, dasatinibe e nilotinibe são utilizados no tratamento da LMC, entretanto, casos de resistência têm sido relacionados à presença de mutações em Bcr-Abl1, duplicação do cr Ph e superexpressão do gene bcr-abl1. A resistência ou refratariedade de alguns pacientes ao tratamento com inibidores de TK impulsiona a realização de estudos para melhor conhecimento da fisiopatologia da LMC e descrição de novos alvos terapêuticos. Nesse contexto, o presente estudo investigou a participação de microRNAs na modulação da expressão de genes que regulam a apoptose. O objetivo geral deste trabalho foi investigar o efeito de bcr-abl1 e da atividade tirosinoquinase de Bcr-abl na expressão desses miRNAs em linhagens celulares e pacientes com LMC. O RNA das linhagens celulares, de pacientes e controles foram obtidos por meio da extração com Trizol® e o cDNA sintetizado com o kit High Capacity cDNA reverse transcription. A expressão dos microRNAs e dos genes alvoss foi quantificada por PCR em tempo real utilizando o kit SYBR Green PCR Master Mix® e TaqMan Universal PCR Master Mix®. A inibição de Bcr-Abl1 na linhagem HL-60.Bcr-Abl1 tratada com o mesilato de imatinibe aumentou a expressão de miR-let-7d, miR-15a, miR-130a e miR-145 e diminuiu os níveis de miR-21. O tratamento com dasatinibe aumentou a expressão de miR-let-7e, miR-15a, miR-16, miR-21, miR-30e, miR-130a e miR-142-3p. O nilotinibe aumentou a expressão de miR-let-7e, miR-15a, miR-16, miR-130a e miR-145 e, diminuiu os níveis de miRlet- 7d e miR-21. Os resultados obtidos da análise entre os de pacientes com LMC em diferentes fases da doença mostraram elevados níveis de miR-15a, miR-130b e miR-145 em pacientes na fase crônica versus controles e baixos níveis de miR-16, miR-26a e miR-146a. Pacientes em fases avançadas versus controles apresentaram baixa expressão de miR-let-7d, miR-16, miR-142-3p, miR-145 e miR-146a. Baixos níveis de miR-let-7d, miR-15a, miR-16, miR-29c, miR-142-3p, miR-145 e miR-146a foram observados nas fases avançadas da LMC em relação a fase crônica. Os genes anti-apoptóticos a1, bcl-2, c-flip, ciap-1 e ciap-2 estavam mais elevados na fase crônica do que nos controles. A expressão do gene c-flip estava diminuída e dos genes a1, ciap-1 e mcl-1 aumentada nas fases avançadas em relação aos controles e a fase crônica. Pacientes com LMC resistentes ao MI apresentaram menores níveis de miR-26a, miR-29c, miR-130b, miR-146a e dos genes anti-apoptóticos ciap-1 e mcl-1. Os dados obtidos sugerem que a TK Bcr-Abl modula a expressão de microRNAs que possuem como alvos genes que regulam a apoptose celular / Chronic myeloid leukemia (CML) is a myeloproliferative disease resulting from clonal expasion of hematopoietic precursor cells. Its physiopathology is associated to Philadelphia (Ph) chromosome (cr) originated from the t(9;22) and bcr-abl1 oncogene that encodes the Bcr-Abl protein with constitutive tyrosine kinase activity (TK). The Bcr-Abl1 expression determines leukemogenesis by altering the leukemic progenitor cells´ adhesion by bone marrow stroma and apoptosis resistance. TK inhibitors imatinib mesylate, dasatinib and nilotinib are used to treat CML, however, cases of resistance have been linked to mutation in Bcr-Abl1, duplication of the cr Ph and overexpression of the bcr-abl1. The resistance or refractoriness of some patients to treatment with TK inhibitors drives the studies to better understand the CML physiopathology and description of new therapeutic targets. In this context, this study investigated the participation of microRNAs in modulating expression of the genes that regulate apoptosis. The aim of this study was to investigate the effect of Bcr- Abl1 and its kinase activity in the expression of miRNAs in cell lines and CML patients. The RNA from cell lines, patients and controls were obtained by extraction with Trizol® and cDNA was synthesized with the kit High Capacity cDNA reverse transcription. The expression of miRNAs and target genes was quantified by real time PCR using SYBR Green PCR Master Mix® kit and TaqMan Universal PCR Master Mix®. The Bcr-Abl1 inhibition in the cell line HL-60.Bcr-Abl1 treated with imatinib mesylate increased the expression of miR-let- 7d, miR-15a, miR-130a and miR-145 and decreased miR-21 levels. Treatment with dasatinib increased the expression of miR-let-7e, miR-15a, miR-16, miR-21, miR-30e, miR-130a and miR- 142-3p. Nilotinib increased the expression of miR-let-7e, miR-15a, miR-16, miR-130a and miR- 145 and, decreased miR-let-7d and miR-21 levels. The results of the analysis among patients with CML in different stages of disease showed high levels of miR-15a, miR-130b and miR-145 in chronic phase versus controls and low levels of miR-16, miR-26a and miR-146a. Patients in advanced phases versus controls showed low expression of miR-let-7d, miR-16, miR-142-3p, miR-145 and miR-146a. Low levels of miR-let-7d, miR-15a, miR-16, miR-29c, miR-142-3p, miR-145 and miR-146a were observed in CML advanced phases when compared with chronic phase. The antiapoptotic genes a1, bcl-2, c-flip, ciap-1 and ciap-2 were higher in chronic phase than in controls. The c-flip expression was decreased and a1, ciap-1 and mcl-1 expression was increased in advanced phases when compared to controls and chronic phase. CML patients resistant to imatinib mesylate presented low levels of miR-26a, miR-29c, miR-130b, miR-146a and ciap-1 and mcl-1 antiapoptotic genes. The data obtained suggest that Bcr-Abl1 TK modulates the miRNA expression which has target genes involved in the apoptosis´ regulation.
| Identifer | oai:union.ndltd.org:usp.br/oai:teses.usp.br:tde-31102014-152954 |
| Date | 25 May 2012 |
| Creators | Ferreira, Aline Fernanda |
| Contributors | Castro, Fabíola Attié de |
| Publisher | Biblioteca Digitais de Teses e Dissertações da USP |
| Source Sets | Universidade de São Paulo |
| Language | Portuguese |
| Detected Language | English |
| Type | Tese de Doutorado |
| Format | application/pdf |
| Rights | Liberar o conteúdo para acesso público. |
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