A busca por novas tecnologias que visam à produção de biocombustíveis renováveis, especialmente bioetanol e outros biomateriais, tem se intensificado nos últimos anos. Há um interesse mundial crescente na limitação dos impactos ambientais e mudanças climáticas através da substituição de produtos petroquímicos por análogos ambientalmente corretos, a fim de alcançar uma economia mais sustentável. Além disso, as plataformas biorrefinarias lignocelulósicas necessárias para a produção de bioetanol representam uma oportunidade de estimular novos mercados para o setor agrícola e aumentar os empregos locais, contribuindo para o desenvolvimento das economias emergentes. No entanto, a maioria dos processos de conversão são baseados no conhecimento empírico, exigindo estudos mais aprofundados sobre os fatores envolvidos na hidrólise enzimática da celulose, tais como características biomassas, a otimização da etapa de pré-tratamento, bem como das atividades das enzimas e seus mecanismos de ação. Assim, com o objetivo de contribuir para a viabilização e implantação das tecnologias de produção do etanol lignocelulósico, na primeira parte deste trabalho de doutorado, foi realizada a purificação da β-glicosidase do fungo Aspergillus Níger (NaBgl1), principal enzima do coquetel comercial Novozymes 188, e sua caracterização bioquímica e biofísica. As análises de espalhamento de raios-x a baixo ângulo revelaram uma organização multidomínios desta enzima, com uma estrutura molecular de girino semelhante ao encontrado para as celulases. A sua estrutura é composta por um domínio catalítico N-terminal e um domínio fibronectina de tipo III (FnIII) na região C-terminal, conectados entre si por um longo linker com uma inserção de 100 resíduos de aminoácidos numa conformação estendida. Apesar desta estrutura molecular incomum, os ensaios de eletroforese capilar revelaram um perfil processividade característico de β-glucosidases, e os ensaios enzimáticos confirmaram, também, a ausência de atividade em substratos poliméricos. Nos ensaios adosrção com diferentes compostos poliméricos, a enzima β-glicosidase mostrou uma capacidade de adsorção elevada em lignina. Os mecanismos de ligação FnIII-lignina foram elucidados por simulações de dinâmica molecular, que confirmaram apresença de vários sítios de ligação à lignina no domínio FnIII da enzima. Como segunda parte da presente tese, diferentes biomassas, como bagaço de cana, resíduos de casca de eucalipto e gramíneas (Panicum maximum, Pennisetum purpureum e Brachiaria brizantha) foram submetidas a vários métodos de pré-tratamento (ácido diluído, alcalino, sulfito e água quente) em diferentes condições de tratamento e avaliadas quanto ao seu potencial para a produção de bioetanol. As biomassas in natura e pré-tratadas foram caracterizadas quanto à sua composição química por métodos cromatográficos, ressonância magnética nuclear e espectroscopia de infravermelho por transformada de Fourier; o índice de cristalinidade das amostras foi determinado por método químico e difração de raios-x; as análises morfológicas foram realizadas por microscopia eletrônica de varredura; e os resultados da caracterização foram correlacionados com os perfis de sacarificação enzimática encontrados para cada uma delas. / The search for new technologies aimed at the production of renewable biofuels, specially bioethanol, and other biomaterials has intensified in recent years. There is an increasing world-wide interest in the limitation of environmental impact and climate change by replacing petrochemical products with environment-friendly analogues in order to move towards a sustainable economy. In turn, the lignocellulosic biorefining platforms required for ethanol production present an opportunity to stimulate new markets for the agriculture sector and increase domestic employment, contributing to the development of emerging economies. However, most of conversion processes are based on empirical knowledge, demanding thorough studies about the factors involved on enzymatic hydrolysis of cellulose, such as biomasses characteristics, optimization of pretreatment steps and enzymes activities and molecular action mechanisms. Aiming to contribute for the viability and establishment of lignocellulosic ethanol technologies, on the first part of the present thesis, we performed the purification of main Aspergillus niger β-glucosidase (AnBgl1) from the commercial cocktail Novozymes 188 and its biochemical and biophysical characterization. The small angle x-ray scattering analysis revealed a multidomain organization, with a tadpole-like molecular shape similar to that found for cellulases. Its structure is composed by a N-terminal catalytic domain and a fibronectin type III-like (FnIII) C-terminal domain, connected by a long linker with a 100 aminoacids residues insertion in a extended conformation. In spite of this uncommon molecular structure, capilar zone electrophoresis assays revealed a processivity profile characteristic of β-glucosidases and the enzymatic assays confirmed no-activity on polymeric substrates. On the pull-dowm assays with different polymeric compounds, the β-glucosidase showed a high adsorption ability to lignin. The FnIII-lignin binding mechanisms were elucidated by molecular dynamics simulations, confirming the multiple binding sites to lignin in the enzyme FnIII domain. As a second part of the present thesis, different biomasses such as sugarcane bagasse, eucalyptus bark residues and grasses (Panicum maximum, Pennisetum purpureum and Brachiaria brizantha) were submitted to several pretreatment methods (diluted acid, alkaline, sulfite and hot water) at various conditions and evaluated about their potential to bioethanol production. The raw and pretreated biomasses were characterized about their chemical composition by chromatographic methods, nuclear magnetic ressonance and Fourier transformed infrared spectroscopy; the crystallinity index was determined by chemical method and x-ray diffraction; morphological features were analysed by scanning electron microscopy; and the characterization results were correlated to their enzymatic saccharification profiles.
| Identifer | oai:union.ndltd.org:IBICT/oai:teses.usp.br:tde-10102013-112701 |
| Date | 07 August 2013 |
| Creators | Marisa Aparecida de Lima |
| Contributors | Igor Polikarpov, Elba Pinto da Silva Bon, Júlio César Borges, Gustavo Henrique Goldman, Ana Maria Souto Maior |
| Publisher | Universidade de São Paulo, Física, USP, BR |
| Source Sets | IBICT Brazilian ETDs |
| Language | Portuguese |
| Detected Language | Portuguese |
| Type | info:eu-repo/semantics/publishedVersion, info:eu-repo/semantics/doctoralThesis |
| Source | reponame:Biblioteca Digital de Teses e Dissertações da USP, instname:Universidade de São Paulo, instacron:USP |
| Rights | info:eu-repo/semantics/openAccess |
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