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Previous issue date: 2008 / Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior (CAPES) / Recentemente, a punção aspirativa por agulha fina (PAAF) vem sendo utilizada como método para a obtenção de material para estudos de expressão gênica em alguns tipos de linfoma, na tentativa de substituir o banco de tumores a partir de tecido fresco congelado. Objetivos: Avaliar a quantidade e a qualidade do RNA obtido a partir de punção aspirativa de linfonodos por PAAF em linfomas nãoHodgkin e desenvolver estratégias para suprir eventuais falhas do método proposto, melhorando a qualidade e/ou a quantidade do material obtido por PAAF. Material e Métodos: A casuística foi constituída pelos pacientes com diagnóstico de LNH admitidos no Hospital São Paulo entre março de 2006 e dezembro de 2007, e que apresentaram linfonodomegalia periférica passível de punção. O grupo controle foi constituído por amígdalas (tecido linfóide reacional) de crianças
submetidas à amigdalectomia no Hospital São Paulo. As punções foram realizadas com citoaspirador (amostra A) e seringa e agulha (amostra B). O RNA foi transcrito com o kit Superscript (Invitrogen) e a qualidade foi verificada a partir da amplificação de fragmentos de 155pb do gene β-ACTINA e de 311 pb do gene
NOTCH-2. Resultados: Foram analisados 26 casos de LNH (52 amostras) e 10 amígdalas (20 amostras). A quantidade de RNA nas amostras de amígdalas obtidas com citoaspirador (A) variou de <1,0 a 6,2 µg. Nas amostras obtidas com
seringa e agulha (B), a quantidade de RNA variou de <1,0 a 4,7µg. A quantidade de
RNA nas amostras de LNH obtidas com citoaspirador (A) variou de <1,0 a 6,5 µg.
Nas amostras obtidas com seringa e agulha (B) a quantidade de RNA variou de
<1,0 a 5,5 µg. Em 19 (95%) das amostras de amígdalas conseguimos amplificar o
fragmento do gene NOTCH-2. Na única amostra de controle em que não foi
possível amplificar o gene NOTCH-2, houve amplificação do fragmento do gene β-
ACTINA (155 pb). Nas amostras de LNH, conseguimos amplificar o fragmento do
gene NOTCH-2 em apenas em 24 (46%) espécimens, mas conseguimos amplificar
o fragmento do gene β-ACTINA em 51 (98%) delas. Na tentativa de aumentar a
quantidade de RNA disponível em cada amostra, padronizamos a técnica de poliA
PCR, que consiste na amplificação global de cDNAs poliadenilados. Conseguimos
evidenciar aumento de 10 vezes na quantidade de cDNA na maioria dos casos e
controles. A eficiência da reação foi verificada através da amplificação do fragmento
do gene β-ACTINA, onde 100% dos controles e dos casos foram amplificados, e
também do fragmento de 298 pb do gene PGK, onde 100% dos controles e 77%
dos casos foram amplificados. Quando utilizamos o produto da reação de poliA
PCR comparados com amostras de cDNA (cDNA versus cDNA poliA) através da
técnica de Real Time PCR, conseguimos demonstrar equivalência nas
amplificações em 100% das 15 amostras avaliadas, utilizando dois genes alvo e um
gene constitutivo. Conclusão: Nossos resultados demonstram que a PAAF, tanto
com o citoaspirador quanto com seringa e agulha, é uma boa fonte de pequena
quantidade de RNA, mas suficiente para amplificar fragmentos de genes de
aproximadamente 150 pb em mais de 95% das amostras. Através da técnica de
poliA PCR conseguimos aumentar significativamente a quantidade de material
genômico, obtendo resultados equivalentes ao uso de cDNA não amplificado, para
futuros estudos de expressão gênica. / Recently, fine needle aspiration (FNA) becomes an alternative method to obtain genomic material for studies of gene expression in some types of lymphoma, in the attempt to substitute fresh frozen tissue tumor banks. Objectives: To evaluate the amount and the quality of the RNA obtained from lymph nodes of non-Hodgkin
lymphomas (NHL) patients using FNAs and to develop strategies to overcome eventual drawbacks of the method. Material and Methods: Twenty-six patients with NHL diagnosis, admitted in São Paulo Hospital, Brazil, between March 2006 and December 2007, presenting peripheral lymphonodemegaly suitable for aspiration were included in this study. The control group includes 10 tonsils from children submitted to tonsillectomy in the same period. The aspirates were performed using both citoaspirator (sample A) and syringe and needle (sample B). The RNA was extracted using Trizol reagent and transcribed with the Superscript kit (Invitrogen). The quality of RNA was verified through the amplification of 155pb fragment from β-ACTIN and 311pb from NOTCH-2. Results: 52 NHL samples and
20 tonsil samples were analyzed. The amount of RNA in tonsil samples varied
from <1.0 a 6.2 µg with citoaspirator (A) and varied from <1.0 a 4.7µg with syringe
and needle (B). The amount of RNA obtained from NHL varied from <1.0 a 6.5 µg
with citoaspirator (A) and <1.0 a 5.5 µg with syringe and needle. In 19 (95%) of the
tonsil samples we could amplify NOTCH-2 fragment. In the only sample of control
where NOTCH-2 amplification was negative, we could easily obtain β-ACTIN
(155pb) amplification. In NHL samples, NOTCH-2 was amplified in only 24 (46%)
specimens, but we obtained β-ACTIN amplification in 51 (98%) of them. In an
attempt to increase the availability of larger amounts of RNA in each sample, we
standardize the polyA PCR technique that consists of the global amplification of
polyadenylated cDNA. This technique increased in 10 times the amount of cDNA
in both cases and controls. The efficiency of the reaction was verified through the
amplification of β-ACTIN, where 100% of the controls and the cases were
amplified, as well through the amplification of PGK (298pb), positive in 100% of
controls and 77% of the cases. When polyA PCR cDNA and non-amplified cDNA
samples where paired to be evaluated by Real Time PCR using GAPDH as
constitutive gene and NFκB and IκB as target genes, we could demonstrate
equivalence in the amplifications of 100% of the 15 evaluated samples.
Conclusion: Our results demonstrate that FNA, whatever citoaspirator or syringe
and needle was used, it is a good source of small amounts of RNA, and could
amplify fragments of approximately 150pb in more than 95% of the samples.
PolyA PCR technique increased significantly of the amount of genomic material
and is suitable as a cDNA source for future gene expression studies. / BV UNIFESP: Teses e dissertações
| Identifer | oai:union.ndltd.org:IBICT/oai:repositorio.unifesp.br:11600/24128 |
| Date | January 2008 |
| Creators | Corbi, Fernanda Cristina [UNIFESP] |
| Contributors | Universidade Federal de São Paulo (UNIFESP), Colleoni, Gisele Wally Braga [UNIFESP] |
| Publisher | Universidade Federal de São Paulo (UNIFESP) |
| Source Sets | IBICT Brazilian ETDs |
| Language | Portuguese |
| Detected Language | English |
| Type | info:eu-repo/semantics/publishedVersion, info:eu-repo/semantics/masterThesis |
| Format | 88 f. |
| Source | reponame:Repositório Institucional da UNIFESP, instname:Universidade Federal de São Paulo, instacron:UNIFESP |
| Rights | info:eu-repo/semantics/openAccess |
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