In den Chloroplasten von höheren Pflanzen sind die Galaktolipide Monogalaktosyldiacylglycerol (MGDG) und Digalaktosyldiacylglycerol (DGDG) die am weitesten verbreiteten Lipide. In dieser Forschungsarbeit wurde die Funktion der DGDG Synthase DGD1, und insbesondere die Funktion des N-terminalen Bereichs dieses Enzyms in der Modellpflanze Arabidopsis thaliana untersucht. Die Überexpression des N-terminalen Bereichs von DGD1 in WT-Col2 resultierte in einem reduzierten Wachstum, welches sich jedoch von der dgd1-1 Mutante unterschied. Dies legte bereits nahe, dass die Expression von N-DGD1 einen negativen Einfluss auf das Wachstum hat. Durch Studien in einem heterologen E.coli Expressionssystem konnte diese These bestätigt werden. Zellen, die ausschließlich N-DGD1 zusammen mit einer MGD Synthase aus Gurke exprimierten, waren im Wachstum stark beeinträchtigt. Nicht nur der N-terminale Bereich von DGD1, auch der N-terminale Bereich von MGD1 besitzt eine Funktion als Transitpeptid und ist somit ein wichtiger Faktor zur korrekten Lokalisierung des MGD1 Proteins. In dieser Arbeit ist es gelungen, ein Fusionskonstrukt aus N-MGD1 und DGD2 in die dgd1-1 Mutante zu transferieren und damit das reduzierte Wachstum zu komplementieren. Frühere Versuche, ein reduziertes dgd1-1 Wachstum mit DGD2 allein zu komplementieren, scheiterten. Somit gibt dies einen Hinweis darauf, dass N-MGD1 als Transitpeptid fungieren kann.
Bindungsstudien zur Interaktion von DGD1 und N-DGD1 Protein zeigten, dass die polaren Lipide MGDG und DGDG in Wechselwirkung mit dem N-terminalen Bereich von DGD1 treten. Bis zum heutigen Zeitpunkt ist nicht erforscht, wie der Transport von DGDG und MGDG zwischen den Hüllmembranen des Chloroplasten erfolgt. Die in dieser Arbeit angefertigen Bindungsstudien konnten Hinweise darauf geben, dass N-DGD1 als eine Art „Antiporter“ fungiert, um MGDG und DGDG zwischen den Hüllmembranen zu transportieren. Weiterhin wurden Bindungsstudien zur Erforschung von Interaktionen der Glykosyltransferasen DGD1, DGD2, MGD1, MGD2 und MGD3 angefertigt. Dabei wurden Wechselwirkungen zwischen den Glykosyltransferasen DGD1, DGD2 und MGD2 detektiert. Interessant ist, dass Hinweise auf eine Dimerbildung bestimmter Enzyme gefunden wurden, so für DGD1 und MGD2. Ein weiterer Ansatz zur Erforschung von Wechselwirkungen von DGD1 Protein mit bis jetzt unbekannten Proteinen war die Expression von DGD1-StrepIITag und DGD1-CTAPTag Fusionsproteinen in dgd1-1 Mutanten. Es wurden für beide Tags transgene Linien generiert, die im Wachstum komplementiert waren und wildtypähnliche Mengen an DGDG akkumulierten. Die Expression der verschiedenen Tags in den Pflanzen war sehr unterschiedlich, wobei der DGD1-CTAP-Tag am stärksten exprimiert war. Mit Pflanzenmaterial dieser Linien kann nun eine Aufreinigung des getaggten Proteins und eventueller Interaktionspartner erfolgen. / The two galactolipids monogalactosyldiacylglycerol (MGDG) and digalactosyl-diacylglycerol (DGDG) constitute the bulk of membrane lipids in chloroplasts. They play a crucial role in organell development and are important for the functionality of photosynthetic complexes in thylakoids. Two DGDG synthases, DGD1 and DGD2, are found in Arabidopsis, and the two proteins localize to the chloroplast envelope membranes. The dgd1 mutant which contains only 10% of wild type amounts of DGDG shows a dwarf phenotype and reduced photosynthetic capacity. The DGD1 protein consists of two domains. While the C-terminal part is responsible for galactosyltransferase activity, no clear function can be attributed to the N-terminal extension. To study the function of the N-terminal part of DGD1 in chloroplast membrane lipid synthesis, translational fusion proteins harboring different DGDG synthase sequences were introduced into wild type and dgd1 mutant plants and analyzed for changes in lipid content and growth. The dgd1 mutant phenotype was complemented with a full-length DGD1 sequence, but not with DGD2. Interestingly, the chimeric fusion of the N-terminal part of DGD1 with DGD2 did complement the dgd1 growth and lipid deficiency. Over-expression of the N-terminal part of DGD1 in wild type Arabidopsis plants affected growth and resulted in alterations of leaf morphology. However, this phenotype was distinct from that observed for dgd1, because these transgenic plants contain normal amounts of galactolipids, and leaves are not yellowish. In conclusion, these data suggest that the N-terminal region of DGD1 might be important for galactolipid transport across the chloroplast envelope membranes towards the thylakoid membranes. Interaction studies between N-DGD1 Protein and different membrane lipids showed an interaction between N-DGD1 Protein and MGDG and DGDG. Till now not much is known about the transport mechanisms of DGDG and MGDG between the chloroplast envelopes. This work gave some indications, that the N-terminal part of DGD1 is involved in the transport of MGDG and DGDG between the chloroplast envelopes. Furthermore interaction studies were made for the glycosyltransferases DGD1, DGD2 MGD1, MGD2 and MGD3. Interactions between DGD1, DGD2 and MGD2 were observed. Another way for finding interacting proteins of DGD1 was the expression of a DGD1-CTAPTag fusion protein in the dgd1-1 mutant. These transgenic lines contained a high amount of DGD1-CTAPTag protein. With these plants its now possible to analyze interacting partners of DGD1 with help of Tandem Affinity Purification method.
| Identifer | oai:union.ndltd.org:Potsdam/oai:kobv.de-opus-ubp:3344 |
| Date | January 2009 |
| Creators | Witt, Sandra |
| Publisher | Universität Potsdam, Mathematisch-Naturwissenschaftliche Fakultät. Institut für Biochemie und Biologie |
| Source Sets | Potsdam University |
| Language | German |
| Detected Language | German |
| Type | Text.Thesis.Doctoral |
| Format | application/pdf |
| Rights | http://opus.kobv.de/ubp/doku/urheberrecht.php |
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