Nos eucariotos, a evolução dos sistemas de transporte molecular foi essencial pois seu alto grau de compartimentalização requer mecanismos com maior especificidade para a localização de proteínas. Com o estabelecimento das mitocôndrias e plastídeos como organelas da célula eucariota, grande parte dos genes específicos para sua atividade e manutenção foram transferidos ao núcleo. Após a transferência gênica, a maioria das proteínas passaram a ser codificadas pelo núcleo, sintetizadas no citosol e direcionadas às organelas por uma maquinaria complexa que envolve receptores nas membranas das organelas, sequências de direcionamento nas proteínas e proteínas citossólicas que auxiliam o transporte. A importação depende em grande parte de uma sequência na região N-terminal das proteínas que contém sinais reconhecidos pelas membranas organelares. No entanto, muito ainda não é compreendido sobre o transporte de proteínas organelares e fatores ainda desconhecidos podem influenciar o direcionamento sub-celular. O objetivo deste trabalho foi a caracterização da General Regulatory Factor 9 (GRF9), uma proteína da família 14-3-3 de Arabidopsis thaliana potencialmente envolvida no direcionamento de proteínas organelares, e a geração de um genótipo para ser utilizado na obtenção de uma população mutante para genes que afetam o direcionamento da proteína Tiamina Monofosfato Sintetase (TH-1). Após experimentos in vivo e in planta, foi observado que GRF9 interage com as proteínas duplo-direcionadas Mercaptopyruvate Sulfurtransferase1 (MST1) e a Thiazole Biosynthetic Enzyme (THI1), e com a proteína direcionada aos cloroplastos TH-1. Experimentos de deleção e interação in vivo mostraram que a região Box1 de GRF9 é essencial para a interação com THI1 e MST1. Com a finalidade de dar continuidade a caracterização da GRF9 e para realização de testes com relação a sua função no direcionamento de proteínas organelares foi gerada uma linhagem homozigota que superexpressa GRF9. Plantas expressando o transgene TH-1 fusionado a Green Fluorescent Protein (GFP) em genótipo deficiente na TH-1 (CS3469/TH-1-GFP) foram obtidas para a geração de população mutante que possibilitará a descoberta de componentes genéticos ainda desconhecidos e responsáveis pelo direcionamento de proteínas aos cloroplastos. / In Eukaryotes, the evolution of molecular transport in the cell was essential due to their increase in compartmentalization, which requires more specific mechanisms for the correct localization of proteins. With the establishment of mitochondria and plastids as organelles, a great number of their genes, either specific for their metabolic functions or maintenance of their own transcription/translation processes, were transferred to the nucleus of the cell. These transfers caused most of the organellar proteins to be coded by the nucleus, then synthesized in the cytosol and targeted to the organelles by a complex machinery which involves membrane receptors in the organelles, targeting sequences in the proteins, and cytosolic proteins which assist them with the transport. Protein import depends greatly on an N-terminal sequence in proteins which has recognizable signals for the organellar membrane receptors. However, much is still not understood about the transport of organellar proteins, and unknown factors may still influence subcellular targeting. The goal of this work was the characterization of General Regulatory Factor 9 (GRF9), a protein of the 14-3-3 family in Arabidopsis thaliana potentially involved in the targeting of organellar proteins, and generating a genotype to be used in obtaining a mutant population for genes affecting the targeting of the protein Thiamine Requiring 1 (TH-1). After in vivo and in planta experiments it was observed that GRF9 interacts with the dual-targeted proteins Mercaptopyruvate Sulfurtransferase1 (MST1) and Thiazole Biosynthetic Enzyme (THI1), and with the chloroplast targeted protein TH-1. Deletion experiments followed by in vivo interaction assays showed that Box 1 region of GRF9 is essential for the interaction with THI1 and MST1. For the continuing characterization of GRF9 and for following tests of its function in the targeting of organellar proteins, a homozygous line was generated overexpressing GRF9. Plants expressing the transgene TH-1 fused to the Green Fluorescent Protein (GFP) in a TH-1 deficient genotype (CS3469/TH-1-GFP) were obtained for the generation of a mutant population which will allow the discovery of genetic components still unknown responsible for targeting proteins to the chloroplasts.
| Identifer | oai:union.ndltd.org:usp.br/oai:teses.usp.br:tde-27062016-094405 |
| Date | 18 April 2016 |
| Creators | Spoladore, Larissa |
| Contributors | Silva Filho, Marcio de Castro |
| Publisher | Biblioteca Digitais de Teses e Dissertações da USP |
| Source Sets | Universidade de São Paulo |
| Language | Portuguese |
| Detected Language | English |
| Type | Tese de Doutorado |
| Format | application/pdf |
| Rights | Liberar o conteúdo para acesso público. |
Page generated in 0.0024 seconds