Kitin er en langkjedet, nitrogenholdig polymer som er bygget opp av N-acetyl-glukosamin-enheter (GlcNAc), og finnes i blant annet det ytre skallet til leddyr, og i celleveggen til sopp. Biosyntese av kitin er katalysert av enzymet kitin syntase som overfører GlcNAc til den ikke-reduserende enden av den voksende polymeren via substratet UDP-GlcNAc. Når kitin deacetyleres dannes det kitosan, som består av en blanding av GlcNAc og GlcN. Kitin og kitosan har en rekke egenskaper som gjør at de har mange ulike bruksområder. De er blant annet biokompatible og biodegraderbare, noe som gjør de svært godt egnet til medisinske og farmasøytiske bruksområder, og kitosan er en effektiv flokkulant på grunn av positivt ladete aminogrupper, og kan brukes til rensing av drikkevann og avløpsvann. Studier av genomsekvensen til E. carotovora har vist at det inneholder en genklynge hvor et gen (ECA2046) koder for en potensiell kitin syntase. Det kan se ut til at flere av genene i samme genklynge, inkludert ECA2046 tilhører samme operon. Formålet med denne oppgaven var å aktivere transkripsjon av ECA2046 ved hjelp av den induserbare PmDI-8 promotoren, og undersøke om dette førte til produksjon av bakteriell kitin. Det var også ønskelig å forsøke å aktivere hele det antatte operonet dersom produktene fra de andre genene er nødvendig for produksjon av en aktiv kitin syntase. Det ble konstruert to ulike rekombineringsvektorer, pKNH25 og pKNH35. I disse vektorene er henholdsvis ECA2046 og ECA2048 klonet inn nedstrøms for PmDI-8. ECA2048 er det første genet i det antatte operonet. Vektorene ble overført ved konjugering fra E. coli S17.1 til E. carotovora. De overførte plasmidene ble integrert i genomet til E.carotovora ved homolog rekombinering. Mutantene ble dyrket videre for å danne ønskede mutanter som hadde fått inkorporert PmDI-8 og xylS, og mistet resten av plasmidet ved videre rekombinering. Det ble funnet en ønsket mutant etter rekombinering med pKNH25, denne ble kalt E.carotovora KNH25, og PmDI-8 i denne mutanten vil kontrollere transkripsjon av ECA2046 og eventuelt nedstrømsgenet ECA2045 som koder for an mulig NAD avhengig epimerase/dehydratase. Ingen ønskede mutanter etter videre rekombinering av muntanten som hadde fått integrert pKNH35 ble funnet, og det var derfor ikke mulig å undersøke om aktivering av transkripsjon av hele det antatte operonet ville føre til produksjon av bakteriell kitin. E.carotovora KNH25 ble dyrket i medium tilsatt induseren m-toluat for å aktivere transkripsjon fra PmDI-8. Analyser av flokkuleringsaktiviteten viste ingen aktivitet, og derfor ingen merkbar produksjon av bioflokkulanter. 1H NMR-analyser ga heller ingen tydelig indikasjon på at det var produsert noe kitosanlignende produkt. Ut ifra NMR-spekteret kan det se ut som det er en blanding av flere stoffer, og grunnet tydelige topper mellom 3,5 og 4 ppm kan det tyde på at det er en annen polymer til stede siden dette område ofte indikerer protoner på sukkermonomerne i polysakkarider. Ved dyrking av både villtypen og mutanten i samme medium, med og uten induser, ble det produsert like store mengder stoff som kan felles med etanol uavhengig av tilstedeværelse av induser. Siden verken målingene av flokkuleringsaktiviteten eller 1H NMR-spekteret gir noen indikasjon på at det er kitosan til stede, og det heller ikke viser seg noen økning i produsert stoff som felles med etanol ved aktivering av PmDI-8 promotoren i E.carotovora KNH25, er det lite som tyder på at aktivering av transkripsjon av kun ECA2046 og eventuelt ECA2045 fører til produksjon av en aktiv kitin syntase, eller et annet aktivt enzym som katalyserer dannelsen av en eventuell polymer som kan felles med etanol.
| Identifer | oai:union.ndltd.org:UPSALLA1/oai:DiVA.org:ntnu-12748 |
| Date | January 2011 |
| Creators | Hagen, Kjersti Næss |
| Publisher | Norges teknisk-naturvitenskapelige universitet, Institutt for bioteknologi, Institutt for bioteknologi |
| Source Sets | DiVA Archive at Upsalla University |
| Language | Norwegian |
| Detected Language | Norwegian |
| Type | Student thesis, info:eu-repo/semantics/bachelorThesis, text |
| Format | application/pdf |
| Rights | info:eu-repo/semantics/openAccess |
Page generated in 0.0023 seconds