Receptores nicotínicos da acetilcolina são encontrados na retina de pintos desde o início do desenvolvimento embrionário. As propostas desse trabalho foram caracterizar esses receptores no desenvolvimento de células de retinas embrionárias de pinto com oito dias, em cultura, e investigar se luzindole, um antagonista de receptores de melatonina, interfere com a atividade, distribuição e número desses receptores. Os ensaios funcionais foram feitos através de microfisiometria, método no qual é medido o aumento da velocidade de acidificação do meio extracelular de células em cultura, provocado pela ativação de receptores por agonistas. Os resultados são expressos como o percentual de aumento da velocidade de acidificação do meio extracelular acetilcolina-estimulado sobre a velocidade de acidificação do meio extracelular basal (ECAR % basal). A eficácia da acetilcolina aumentou do quarto dia de cultura para o quinto dia, decaindo ao oitavo dia, sendo bloqueada de modo dependente de concentração por dihidro-β-eritroidina (a partir de 10 µM), ao quarto dia e por α-bungarotoxina (10nM), ao quinto e sexto dia de cultivo, não ocorrendo o inverso. Para os ensaios de ligação, utilizou-se [125I] α-bungarotoxina, e ao quarto dia de cultivo houve maior número de sítios, menor afinidade e maior grau de cooperatividade. Ao quinto dia de cultivo ocorreu o inverso. Foi investigado, por imunocitoquímica, o desenvolvimento da distribuição da imunorreatividade para as subunidades α3 e α8 e ambas foram encontradas em culturas de quatro e seis dias, estando α3 principalmente em corpos neuronais e dendritos proximais e α8 principalmente em prolongamentos. O tratamento crônico com luzindole não interferiu com o padrão de distribuição das subunidades α3 e α8 em culturas de quatro ou seis dias, em nenhum tempo de cultivo. Também não interferiu no número de sítios, na constante de associação e no tempo de equilíbrio da ligação de [125I] α-bungarotoxina, nas culturas cultivadas por cinco dias. Entretanto, a resposta à acetilcolina em culturas de cinco e seis dias foi inibida de modo concentração e tempo dependente por luzindole, sem apresentar somação com a inibição por α-bungarotoxina. Concluiu-se que na cultura de células de retina a eficácia do agonista acetilcolina é dependente do desenvolvimento, se deve principalmente a receptores formados de subunidades α3 e α8, ao quarto e quinto dias de cultivo, respectivamente, e que o bloqueio de receptores de melatonina com luzindole inibe a resposta à acetilcolina somente ao quinto e sexto dias de desenvolvimento, provavelmente, pela inibição de outro sistema de neurotransmissão, localizado nos mesmos neurônios que contém receptores sensíveis a α-bungarotoxina em suas ramificações, como o sistema glutamatérgico. / Nicotinic acetylcholine receptors are expressed in the chick retina very early in embryonic development. The present study aimed to characterize the nicotinic acetylcholine receptors during embryonic chick retinal cell culture development and to investigate if luzindole, a melatonin receptor antagonist, is able to change the activity, distribution, and number of these receptors. The functional assays were done by microphysiometry, a method in which the increasing, agonist-stimulated, extracellular acidification rate is measured in cultured cells. The results are expressed in terms of the percentual of the acetylcholine-stimulated extracellular acidification rate over the basal extracellular acidification rate (% basal ECAR). The acetylcholine efficacy increased from the fourth to the fifth day, diminishing at the eighth culture day, and was inhibited, concentration-dependently, by dihydro-β-erythroidine (starting at 10 µM), in the retinal cells cultured for four days, and by α-bungarotoxin (10nM), in the retinal cells cultured for five and six days. The opposite did not occur. We have used [125I] α-bungarotoxin for the binding assays, and retinal cells cultured for four days presented in these assays a higher maximal-binding, smaller affinity, and higher degree of the cooperativity than retinal cells cultured for five days. Immunocytochemistry was used to characterize the development of the α3 and α8 subunits. Each of these subunits was characteristically distributed throughout the cell, independent of the age of culture. Alpha3 was mainly observed in the perikarya and proximal dendrites, whereas α8 was basically seen in processes. The distribution of the α3 and α8 immunoreactivity was not changed after chronic luzindole treatment. Also, the time of the equilibrium, the association rate, and the number of the [125I] α-bungarotoxin (10nM) binding sites were not different with or without chronic luzindole treatment in cells cultured for five days. However, the acetylcholine efficacy in the retinal cells cultured for five and six days was inhibited by luzindole, an effect that was concentration and time dependent, and that exhibited no summation with the inhibition by α-bungarotoxin. In conclusion, the acetylcholine efficacy is dependent on retinal cell culture development, and it acts mainly through neuronal nicotinic receptors comprising α3 subunits in the fourth day, and α8 subunits in the fifth day. Acetylcholine action is inhibited by melatonin receptor blockage by luzindole only at the fifth and sixth days, probably by inhibition of other receptors located in the same cells that harbor α-bungarotoxin-sensitive receptors, such as glutamate receptors.
| Identifer | oai:union.ndltd.org:usp.br/oai:teses.usp.br:tde-24032003-103834 |
| Date | 04 February 2002 |
| Creators | Sampaio, Lucia de Fatima Sobral |
| Contributors | Markus, Regina Pekelmann |
| Publisher | Biblioteca Digitais de Teses e Dissertações da USP |
| Source Sets | Universidade de São Paulo |
| Language | Portuguese |
| Detected Language | English |
| Type | Tese de Doutorado |
| Format | application/pdf |
| Rights | Liberar o conteúdo para acesso público. |
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