Blockering av NKG2A receptorn på NK - och CD8+ T celler med en anti-NKG2A antikropp, medför en aktivering av cytolytisk aktivitet, och är en lovande immunkontrollpunkt i immunterapi mot cancer. Nyligen har en TCR-liknande antikropp, EXX1, som binder till liganden för NKG2A receptorn, Qa-1b - en icke-klassisk MHC klass Ib molekyl i möss -studerats i tumör modeller in vitro. Resultat påvisar att den TCR-liknande antikroppen endast binder till Qa-1b om denna presenterar Qdm peptiden på sin yta, som erhålls från ledarsekvensen hos klassika MHC klass Ia H-2D. Detta väcker frågor kring strukturella faktorer som möjliggör antigenpresentation på Qa-1b och de exakta molekylära parametrarna som ger upphov till antikroppens specificitet. Syftet med denna studie var att bestämma och jämföra kristallstrukturerna för Qa-1b med Qdm (AMAPRTLLL) samt peptid 001 (AQAERTPEL). Den tunga peptidkedjan hos Qa-1b och beta-2-mikroglobulin producerades rekombinant i E.coli, återveckades med respektive peptid, renades med kromatografimetoder och slutligen kristalliserades genom ångdiffusionsmetoden med hängande droppar. Värmestabilitet hos MHC/peptid undersöktes med nano differential scanning fluorimetry, där Qa-1b /001 uppvisade bättre stabilitet. Kristaller för Qa-1b /Qdm och Qa-1b /001 kunde erhållas med 8% PEG4000, 10mM NiCl2, 0.1M natriumacetat vid pH 5.7, respektive 10% PEG4000, 10 mM NiCl2 och 0.1 M natriumacetat vid pH 6.0. Strukturen för Qa-1b /001 kunde bestämmas vid 2.43 Å med molekylär ersättning. Med anledning av negativt laddade sidogrupper i peptid 001 som har en ytlig konformation i bindningsfickan, kan avsaknaden av bindning till EXX1 förklaras av en skillnad i elektrostatiska interaktioner mellan Qdm och peptid 001. Ytterligare strukturella karakteriseringar av Qa-1b komplexen med antikroppen är av fortsatt stort intresse. / Blocking of the NKG2A receptor expressed on NK cells and CD8+ T cells with an anti-NKG2A antibody for elicitation of cytolytic activity, is a promising immune checkpoint in cancer immunotherapy. EXX1, a novel TCR-like antibody with specificity for the NKG2A ligand, Qa-1b - a murine non-classical MHC class Ib ortholog of HLA-E - has been assessed in tumor models in vitro. The antibody only engages with Qa-1b when it presents the dominant peptide Qdm, derived from the leader sequence of the classical MHC class Ia H-2D. This raises questions about the structural features of antigen presentation by Qa-1b, and the molecular parameters driving the specificity of the TCR-like antibody. The purpose of this study is to determine and compare the crystal structures of Qa-1b in complex with Qdm (AMAPRTLLL) and peptide 001 (AQAERTPEL). The Qa-1b heavy chain and mouse beta-2 microglobulin were recombinantly expressed in E.coli, refolded in the presence of respective peptide, purified using size exclusion chromatography and crystallized with the hanging drop vapor diffusion method. Thermal stability of the MHC/peptide complexes was assessed with nano differential scanning fluorimetry, implying a higher stability of Qa-1b/001. Crystals of the Qa-1b/Qdm and Qa-1b/001 were obtained with 8% PEG4000, 10 mM NiCl2, 0.1 M sodium acetate at pH 5.7, and 10% PEG4000, 10mM NiCl2 and 0.1 M sodium acetate at pH 6.0, respectively. The structure of Qa-1b/001 was resolved by molecular replacement at 2.43 Å, and the presence of negatively charged side chains that protrude from the binding groove, may imply that differences in electrostatic interactions between Qdm and 001 will determine antibody-binding. Further structural characterizations, of Qa-1b complexes with bound EXX1 are of great interest.
| Identifer | oai:union.ndltd.org:UPSALLA1/oai:DiVA.org:kth-314593 |
| Date | January 2022 |
| Creators | AI-Tamimi, Lejla |
| Publisher | KTH, Proteinvetenskap |
| Source Sets | DiVA Archive at Upsalla University |
| Language | English |
| Detected Language | English |
| Type | Student thesis, info:eu-repo/semantics/bachelorThesis, text |
| Format | application/pdf |
| Rights | info:eu-repo/semantics/openAccess |
| Relation | TRITA-CBH-GRU ; 2022:199 |
Page generated in 0.0021 seconds