In der vorliegenden Arbeit wurde die Präsentationsfunktion der LEW-Ratten-MHC-Klasse-II-Moleküle RT1B und RT1D für verschiedene Super- und Peptidantigene sowie die Generierung gemischter MHC-Klasse-II-Isotypen in der LEW-Ratte untersucht. Sag sind Proteine bakterieller und viraler Herkunft und führen nach Bindung an MHC-Klasse-II-Moleküle durch Interaktion mit dem TZR-Vb-Teil zu einer von der TZR-Spezifität unabhängigen Aktivierung von T-Zellen, die bis zu 30 % der Gesamt-T-Zellpopulation eines Organismus erfassen kann. Die dadurch bedingte Mediatorenfreisetzung aus T- oder konsekutiv aktivierten Zellen ist einerseits für die Entwicklung bestimmter akuter Krankheitsbilder wie des toxischen Schocksyndroms, Gastroenteritiden u. a. verantwortlich, kann aber auch potentiell zu einer Aktivierung autoreaktiver T-Zellen und der Entstehung von Autoimmunkrankheiten beitragen. Zur Untersuchung der LEW-MHC-Klasse-II-Charakteristika wurden zunächst mittels retroviralen Gentransfers RT1B- und RT1D-Gene in L929-Zellen übertragen und die Oberflächenexpression durch die mAK Ox6 und 14-4-4S nachgewiesen. Anschließend erfolgte der Nachweis einer Sag-Präsentation durch Stimulation des LEW-Vb8.2-TZH 53/4 durch die bakteriellen Sag SEB, SEC1-3, MAS und YPM und von aus Lymphknoten isolierten LEW-T-Zellen durch SEC1, MAS und YPM, die beide mit der durch eine HLA-DR1-positive Zelllinie getragenen Aktivierung verglichen wurden. Beide Experimente ergaben für die Sag des primär humanpathogen Staph. aureus eine weitaus stärkere Reaktivität in Anwesenheit humaner gegenüber LEW-MHC-Klasse-II-Molekülen bei RT1B-dominierter Antwort innerhalb der präsentatorischen Rattenmoleküle. Für SEB ergaben sich zusätzlich Hinweise auf eine MHC-Klasse-II-unabhängige Aktivierung. Das von Yersinia pseudotuberculosis produzierte Sag YPM wurde ebenfalls wesentlich besser von humanen als LEW-MHC-Klasse-II-Molekülen präsentiert, zeigte allerdings nur geringe Unterschiede zwischen RT1B und RT1D. Für das aus Nagern isolierte Sag von Mykoplasma arthritidis MAS konnte eine präferentielle Bindung an RT1D mit HLA-DR1-ähnlicher Stimulationskapazität nachgewiesen werden. Darüber hinaus wurden die generierten Zelllinien auf Präsentation der definierten Antigene L.casein und gpMBP gegenüber reaktiven TZH getestet. Dabei konnte die RT1D-restringierte Antwort von Klon19 auf L.casein und die RT1B-restringierte Antwort von 53/4 auf gpMBP bestätigt werden. Ebenfalls wurden die erstellten Transfektanten mit einem viralen Sag der Maus, dem vSag7-Gen des mtv7, transfiziert und auf Stimulation des TZH RG17 und von LEW-Lymphozyten getestet. Dabei zeigte sich eine geringe Reaktivität gegenüber den erstellten Transfektanten, die RT1B-dominiert war. Gleichzeitig ergaben sich in der Auswertung Hinweise für einen vSag7-Transfer von MHC-Klasse-II-negativen Produzenten auf MHC-Klasse-II-positive Rattenzellen, die durch weitere Experimente inklusive eines In-vivo-Tests bestätigt werden konnten. In der Generierung gemischter Isotypen aus MHC-Klasse-II-Einzelkettengenen der LEW-Ratte konnte gezeigt werde, dass die Übertragung der RT1DaBb-Genkombination mit Hilfe eines retroviralen Gentransfers auf P80- und L929-Zellen nicht zu einer sicher detektierbaren Oberflächenexpression führte, auch nicht bei Koübertragung der invarianten Kette der Maus. Durch einen Western Blot unter reduzierenden Bedingungen konnte eine bezüglich Molekulargewicht und Quantität zu einem regulären RT1B-Molekül differente RT1Bb-Einzelkette in der Kombination RT1DaBb nachgewiesen werden. / In the work at hand the presenting function of LEW rat MHC class II molecules RT1B and RT1D for various superantigens and antigens as well as the generation of mixed MHC class II isotypes in the LEW rat have been investigated. Superantigens are proteins of bacterial and viral origin, which lead to a TCR-specificity-independent activation of up to 30 % of the individual's T-cell population by interacting with the Vb part of the T-cell receptor after having bound to an MHC class II molecule. The release of mediators by T- and consecutively activated cells causes on the one hand development of acute diseases like toxic shock syndrome, gastroenteritis and other, but can also potentially activate autoreactive T-cells and lead to autoimmune diseases. In order to examine characteristics of LEW MHC class II molecules, first RT1B and RT1D chain genes were transferred into L929 cells via a retroviral transfection system and surface expression was demonstrated by using the monoclonal antibodies Ox6 and 14-4-4S. Successively, superantigen presentation was verified by stimulation of the LEW Vb8.2+ T-cell hybridoma 53/4 by bacterial superantigens SEB, SEC1-3, MAS and YPM and of LEW T-cells isolated from lymph nodes by SEC1, MAS and YPM. Both results were compared to activation in context of an HLA-DR1+ cell line. Experiments showed a much higher reactivity for the superantigens of human pathogen staph. aureus in presence of human versus LEW MHC class II molecules and an RT1B dominated answer amongst LEW presentatory molecules. Additionally, clues for MHC class II independent activation were found in case of SEB. The superantigen of yersinia pseudotuberculosis YPM was also much better presented by human than LEW MHC class II molecules while showing little differences between RT1B and RT1D. MAS bound preferentially to RT1D and equal stimulative capacity compared to HLA-DR1 could be detected. Accessorily, generated cell lines were analysed for presentation of peptide antigens L.casein and gpMBP towards reactive T-cell hybridomas, in which RT1D-restricted answer of Klon19 to L.casein and RT1B-restricted answer of 53/4 to gpMBP could be confirmed. Also generated cell lines were transfected with a viral mouse superantigen, the vsag7 gene of mtv7, and tested for stimulation of the RG17 T-cell hybridoma and LEW lymphocytes. Low reactivity towards transfected cell lines was detected, which was dominated by RT1B. Additionally, evidence for a transfer of vsag7 from MHC class II- producers to MHC class II+ rat cells could be found, which was enhanced by additional experiments including in vivo testing. Attempting to create mixed isotypes consisting of LEW rat MHC class II chains, it was demonstrated, that transferring the gene combination RT1DaBb via retroviral gene transfer into P80 and L929 cell lines resulted in no certain surface expression, also not under cotransfection of these cells with mouse invariant chain. Using western blot method under reducing conditions, a RT1Bb single chain different to the one of the regular RT1B molecule concerning molecular weight and quantitiy could be detected in the combination RT1DaBb.
| Identifer | oai:union.ndltd.org:uni-wuerzburg.de/oai:opus.bibliothek.uni-wuerzburg.de:2377 |
| Date | January 2008 |
| Creators | Dlaske, Henry |
| Source Sets | University of Würzburg |
| Language | deu |
| Detected Language | German |
| Type | doctoralthesis, doc-type:doctoralThesis |
| Format | application/pdf, application/pdf |
| Rights | info:eu-repo/semantics/openAccess |
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