Mémoire numérisé par la Direction des bibliothèques de l'Université de Montréal. / L'algue unicellulaire Gonyaulax polyedra est notre modèle pour l'étude
des mécanismes reliant l'horloge interne aux rythmes circadiens observés. La
bioluminescence, présente lors de la phase de nuit, ainsi que la division
cellulaire observée au début de la phase de jour sont les deux rythmes sur
lesquels porte la présente étude. Chez Gonyaulax, la présence des protéines
LBP et luciférase, limitée à la phase obscure, permet la production de lumière.
Une régulation au niveau de la traduction par une protéine inhibitrice CCTR se
fixant en région 3 de l'ARNm LBP permet l'expression cyclique de la protéine
LBP in vivo chez Gonyaulax polyedra . La construction d'une banque
d'ADNc dans un vecteur d'expression constitutive (le p425 GPD) représente
l'outil nécessaire pour l'isolation d'un ADNc codant pour la protéine CCTR.
Cette isolation repose sur un mécanisme moléculaire d'interaction in vivo de la
protéine CCTR avec la région régulatrice de l'ARNm lbp annexée à un gène
létal inductible (le gène GSP1) dans la construction du plasmide pCS7. La
transformation de levure possédant le pCS7 avec la banque d'ADNc
permettrait la production de CCTR actif dans la levure et ainsi l'inhibition de la
traduction de l'ARNm GSP1 par fixation du CCTR à la région régulatrice de
lbp. Le criblage d'une banque d'ADNc comportant 2,8 x 105clones a été
effectué. La croissance de 127 colonies a été observée lors du premier criblage
de la banque. Chaque colonie a été soumise à une extraction d'ADN
plasmidique et les plasmides obtenus ont été utilisés pour une seconde
transformation dans les levures porteuses du pCS7. Le second criblage nous a
permis de constater qu'aucun de ces positifs ne peut produire une protéine
CCTR fonctionnelle. Une contamination par des levures d'une autre souche ou
par une source de carbone permettant la croissance (telle que le glucose), une
présence de "révertants" ou le clonage d'un ADNc codant pour le facteur de
sélection du pCS7 peuvent être à l'origine de ces "faux positifs" obtenus. La
production de clones supplémentaires afin d'augmenter statistiquement les
chances de représentation d'un gène impliqué dans la génération d'un rythme circadien, ainsi que la transformation répétée de la banque dans les mêmes
cellules pour permettre de réunir les différentes composantes qui pourraient
être nécessaires à la formation d'un CCTR actif, pourraient permettre d'isoler
un ADNc codant pour une protéine CCTR active.
Chez la majorité des dinoflagellés on observe la présence d'une phase
S dans le cycle cellulaire. De plus, chez Gonyaulax, la division cellulaire est
limitée à l'aurore. Il est donc probable que la protéine kinase p34œk2qui régule
la formation de l'hétérodimère MPF (impliqué dans l'initiation de la division
cellulaire) soit également sujette à une régulation par l'horloge circadienne.
L'isolation d'un homologue de la protéine kinase p34ede2repose sur une
technique de clonage par compensation d'une mutation. Les levures de la
souche cdc28 ne peuvent se diviser normalement à température restrictive de
34°C à cause d'une mutation thermosensible de la protéine kinase p34edc2. La
transformation de la banque d'ADNc construite dans des levures de cette
souche, puis l'incubation à température restrictive, permet le criblage pour un
homologue de la p34cdc2. Le premier criblage de la banque a permis la
croissance de sept colonies qui ont toutes été soumises à une extraction d'ADN
plasmidique puis à une retransformation dans les cellules de la souche cdc28.
Aucun des positifs n'a franchi le seuil de ce second test. Le criblage de clones
supplémentaires ou encore le criblage pour un homologue de la cycline (la
seconde composante du MPF) pourrait permettre d'isoler directement ou
indirectement l'homologue de la p34cdc2.
| Identifer | oai:union.ndltd.org:umontreal.ca/oai:papyrus.bib.umontreal.ca:1866/32984 |
| Date | 02 1900 |
| Creators | Chaput, Hélène |
| Contributors | Morse, David |
| Source Sets | Université de Montréal |
| Language | fra |
| Detected Language | French |
| Type | thesis, thèse |
| Format | application/pdf |
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