O objetivo deste estudo foi avaliar a técnica de espectrometria de massas por ionização/dessorção a laser assistida por matriz tempo-de-vôo (MALDI-TOF) para a identificação direta em amostras de leite (sem cultivo microbiológico) de bactérias causadoras de mastite. Para tanto foram realizados dois experimentos (1 e 2). No experimento 1, o objetivo foi determinar a sensibilidade diagnóstica da técnica MALDI-TOF MS para a identificação direta em amostras de leite de Staphylococcus aureus, Streptococcus uberis, Streptococcus agalactiae, Streptococcus dysgalactiae e Escherichia coli. Foram realizadas contaminações experimentais de S. aureus, S. uberis, S. agalactiae, S. dysgalactiae e E. coli em amostras de leite, para a obtenção de contagens de 103 a 109 ufc/mL. As amostras de leite contaminadas foram processadas com o uso do kit Maldi Sepsityper® (Bruker Daltonics) e submetidas ao protocolo de lise bacteriana para posterior análise por MALDI-TOF MS. Espectros de massas foram coletados na faixa de massas de 2.000-20.000 m/z e foram analisados pelo programa MALDI Biotyper 3.0 (Bruker Daltonics) com as configurações padrão para obtenção da identificação bacteriana. A identificação direta de patógenos causadores de mastite a partir de amostras de leite foi possível em contagem ≥106 ufc/mL para S. aureus, ≥107 ufc/mL para E. coli, e ≥108 ufc/mL para S. agalactiae, S. dysgalactiae e S. uberis. No experimento 2, o objetivo foi avaliar o efeito da pré-incubação de amostras de leite de quartos mamários com mastite subclínica sobre a eficácia da identificação sem cultivo de patógenos causadores de mastite por MALDI-TOF MS. Foram selecionados 2 rebanhos leiteiros para coletas de leite de quartos mamários de todas as vacas em lactação. As amostras de leite foram submetidas às análises de: a) cultura microbiológica; b) pré-incubação seguida de identificação por espectrometria de massas diretamente do leite; c) contagem bacteriana total (CBT). Para a realização da CBT, as amostras de leite foram submetidas à citometria de fluxo; e para a identificação direta de patógenos causadores de mastite a partir do leite, as amostras foram submetidas ao desnate por centrifugação (10.000 Xg por 10 minutos), e pré-incubação a 37ºC por 12 horas. Posteriormente, as amostras foram processadas com o uso do kit Maldi Sepsityper® (Bruker Daltonics) e submetidas ao protocolo de lise bacteriana para posterior análise por MALDI-TOF MS. Do total de 810 amostras de leite analisadas por cultura microbiológica (método referência), 347 apresentaram crescimento bacteriano, sendo 305 identificadas como agentes de interesse na identificação direta pelo método MALDI-TOF MS: Staphylococcus coagulase negativa (n=191), S. aureus (n=31), S. agalactiae (n=42), S. uberis (n=37), S. dysgalactiae (n= 4). Sendo assim, 305 amostras foram analisadas pelo método de idenfificação direta MALDI-TOF MS, a qual apresentou baixa sensibilidade quando comparado com a cultura microbiológica (método referência): Staphylococcus coagulase negativa (14,08%), S. agalactiae (15,25%), S. uberis (1,69%) S. aureus (6,12%) e S. dysgalactiae (0%). A pré-incubação de amostras de leite não aumentou a sensibilidade de identificação direta de microrganismos causadores de mastite pelo método MALDI-TOF MS. / The purpose of the present study was to evaluate the technique of mass spectrometry by desorption / ionization assisted laser array time-of-flight (MALDI-TOF MS) for the direct identification in milk samples (no microbiological culture) of mastitis causing bacteria. Therefore, we carried out two experiments (1 and 2). In experiment 1, we determined the diagnostic sensitivity of MALDI-TOF MS technique for the direct identification in milk samples of Staphylococcus aureus, Streptococcus uberis, Streptococcus agalactiae, Streptococcus dysgalactiae and Escherichia coli. Experimental contamination of S. aureus, S. uberis, S. agalactiae, S. dysgalactiae and E. coli in samples of milk to a concentration of 103-109 cfu/mL were performed. The contaminated milk samples were processed using kit Maldi Sepsityper® (Bruker Daltonics) and subjected to bacterial lysis protocol for analysis by MALDI-TOF MS. Mass spectra were collected in the mass range of 2000-20000 m/z and were analyzed by MALDI Biotyper 3.0 software (Bruker Daltonics) with default settings to obtain bacterial identification. Direct identification of mastitis causing pathogens from milk samples was possible at ≥106 cfu/mL for S. aureus, ≥107 cfu/mL for E. coli and ≥108 cfu/mL for S. agalactiae, S. dysgalactiae and S. uberis. In experiment 2, the objective was to evaluate the effect of pre-incubation of milk samples from mammary quarters with subclinical mastitis on the effectiveness of identification without cultivation, of mastitis-causing pathogens by MALDI-TOF MS. We selected mammary quarter milk samples from all lactating cows on two dairy herds. The milk samples were subjected to analyzes of: a) microbiological culture; b) pre-incubation followed by identification by mass spectrometry directly from milk; c) total bacterial count (TBC). Flow cytometry was used to determine TBC and; to directly identify the mastitis-causing pathogens from milk, fat was separated by centrifugation (10,000 Xg for 10 minutes) and; samples were pre-incubated at 37°C for 12 hours. Subsequently, the skim milk samples were submitted to kit Maldi Sepsityper® (Bruker Daltonics) and to the bacterial lysis protocol for analysis by MALDI-TOF MS. A total of 810 milk samples were analyzed by microbiological culture (reference method), of which 347 showed bacterial growth. Considering all culture positive samples 305 were identified as agents of interest in the direct identification by MALDI-TOF MS method: coagulase negative staphylococci (n = 191), S. aureus (n = 31), S. agalactiae (n = 42), S. uberis (n = 37) and S. dysgalactiae (n = 4). Therefore, 305 samples were directly identified by MALDI-TOF MS, which presented low sensitivity when compared to microbiological culture (Reference method): coagulase-negative staphylococci (14.08%), S. agalactiae (15.25 %), S. uberis (1.69%), S. aureus (6.12%) and S. dysgalactiae (0%). Pre-incubation of milk samples did not increase the sensitivity of the MALDI-TOF MS method directly identify mastitis-causing microorganisms.
| Identifer | oai:union.ndltd.org:usp.br/oai:teses.usp.br:tde-25082015-165957 |
| Date | 26 February 2015 |
| Creators | Barreiro, Juliana Regina |
| Contributors | Santos, Marcos Veiga dos |
| Publisher | Biblioteca Digitais de Teses e Dissertações da USP |
| Source Sets | Universidade de São Paulo |
| Language | Portuguese |
| Detected Language | Portuguese |
| Type | Tese de Doutorado |
| Format | application/pdf |
| Rights | Liberar o conteúdo para acesso público. |
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