Submitted by Cláudia Bueno (claudiamoura18@gmail.com) on 2016-06-09T21:26:35Z
No. of bitstreams: 2
Dissertação - Kelly de Souza Fernandes - 2016: 2715711 bytes, checksum: a2c065301e1443bb424fa23c738e43d2 (MD5)
license_rdf: 23148 bytes, checksum: 9da0b6dfac957114c6a7714714b86306 (MD5) / Approved for entry into archive by Luciana Ferreira (lucgeral@gmail.com) on 2016-06-10T13:24:18Z (GMT) No. of bitstreams: 2
Dissertação - Kelly de Souza Fernandes - 2016: 2715711 bytes, checksum: a2c065301e1443bb424fa23c738e43d2 (MD5)
license_rdf: 23148 bytes, checksum: 9da0b6dfac957114c6a7714714b86306 (MD5) / Made available in DSpace on 2016-06-10T13:24:18Z (GMT). No. of bitstreams: 2
Dissertação - Kelly de Souza Fernandes - 2016: 2715711 bytes, checksum: a2c065301e1443bb424fa23c738e43d2 (MD5)
license_rdf: 23148 bytes, checksum: 9da0b6dfac957114c6a7714714b86306 (MD5)
Previous issue date: 2016-02-15 / Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior - CAPES / Miltefosine (MT) is a alkylphospholipid originally developed for treatment
of breast cancer and other solid tumors. It is currently used in the treatment of
leishmaniasis, an infectious parasitic disease caused by protozoa of the genus
Leishmania, being the first oral drug adopted for this purpose. However, its
mechanism of action remains unclear. Electron paramagnetic resonance (EPR)
spectroscopy of a spin-labeled lipid (5-DOXIL stearate) and a thiol-specific spin
label (4-maleimido-TEMPO) in the membrane of axenic amastigotes of
L.(Leishmania) amazonensis and peritoneal macrophages from Balb/c mice
showed that MT causes significant increase in membrane dynamics at similar
concentrations that inhibit parasite growth or are cytotoxic to macrophage.
Although these alterations can be detected using a spin-labeled lipid, our
experimental results indicated that MT interacts predominantly with the protein
component of the membrane. Using a method for the rapid incorporation of MT
into the membrane, these effects were measured immediately after treatment.
Cytotoxicity, estimated via microscopic counting of living and dead cells,
indicated ~80% parasites and macrophages death at the concentration of MT at
which EPR spectroscopy detected a significant change in membrane dynamics.
Cell viability, analyzed using the MTT (3-(4,5-dimethylthiazol-2-yl)-2,5-
diphenyltetrazolium bromide tetrazolium) reduction assay, showed that 50%
inhibitory concentration (IC50) of MT depends on the cell concentration used in
the assay. This dependence was analyzed using a theoretical equation
involving biophysical parameters such as the partition coefficient of watermembrane
and MT concentrations on the membrane and in the aqueous
medium. The data showed that cells more sensitive to MT are respectively:
erythrocytes, Leishmania promastigotes and Leishmania amastigotes and
macrophage. The IC50 value of MT for 4 x 107 parasites/mL was 24,35 M. For
the same cell concentration, a significant alteration was detected in the
membrane lipid fluidity of parasites to 15 M of MT. The EPR spectra of spinlabeled
membrane-bound proteins were consistent with more expanded and
solvent exposed protein conformations, suggesting a detergent-like action, with
a possible formation of micelle-like structures around polypeptide chains. / A Miltefosina (MT) é um alquilfosfolipídio originalmente desenvolvido
para o tratamento de câncer de mama e outros tumores sólidos. Atualmente é
utilizada no tratamento da leishmaniose, uma doença infecto-parasitária
causada pelo protozoário do gênero Leishmania, sendo o primeiro fármaco de
uso oral aprovado para tal fim. No entanto, seu mecanismo de ação ainda é
pouco conhecido. A espectroscopia de Ressonância Paramagnética Eletrônica
(RPE) de um marcador de spin lipídico (5-DOXIL estearato) e outro específico
de grupo tiol (4-maleimido-TEMPO) na membrana de amastigotas axênicas de
L. (Leishmania) amazonensis e de macrófagos extraídos de peritônio de
camundongos BALB/c, mostrou que a MT causa um aumento significativo na
dinâmica destas membranas para concentrações similares àquelas que inibem
o crescimento do parasito ou que são citotóxicas ao macrófago. Embora essas
alterações possam ser detectadas usando um marcador de spin lipídico,
nossos resultados experimentais indicaram que a MT interage
predominantemente com a componente proteica da membrana. Utilizando um
método para incorporação rápida da MT na membrana, esses efeitos foram
medidos imediatamente após o tratamento. Ensaios de citotoxicidade, estimada
via contagem microscópica de células vivas e mortas, indicaram que ~80% dos
parasitos e dos macrófagos estão mortos na concentração de MT no qual a
espectroscopia de RPE detectou uma mudança significativa na dinâmica da
membrana. A viabilidade celular, quantificada pela redução do sal MTT ((3-4,5-
Dimetiltiazol-2yl)-2,5 difenil brometo de tetrazolina), mostrou que a
concentração de MT que inibe 50% da proliferação celular (IC50) depende da
concentração celular usada no ensaio. Esta dependência foi analisada
utilizando uma equação teórica envolvendo parâmetros biofísicos tais como o
coeficiente de partição membrana-água e concentrações de MT na membrana
e no meio aquoso. Os dados mostraram que as células mais sensíveis à MT
são respectivamente: eritrócitos, formas promastigotas e amastigotas da
Leishmania e macrófagos. O valor do IC50 da MT para 4 x 107 parasitos/mL foi
de 24,35 M. Para esta mesma concentração de células, foi detectada uma
alteração significativa na fluidez lipídica da membrana dos parasitos com 15 M de MT. Os espectros de RPE do marcador de spin ligados a proteínas da
membrana foram consistentes com as conformações mais expandidas e
dinâmicas das proteínas expostas no solvente, sugerindo uma ação
semelhante à de detergente, com uma possível formação de estruturas tipo
micelas em volta das cadeias polipeptídicas.
Identifer | oai:union.ndltd.org:IBICT/oai:repositorio.bc.ufg.br:tede/5684 |
Date | 15 February 2016 |
Creators | Fernandes, Kelly de Souza |
Contributors | Alonso, Antonio, Dorta, Miriam Cristina Leandro, Alonso, Antonio, Dorta, Miriam Cristina Leandro, Izumi, Erika, Souza, Paulo Eduardo Narcizo de, Oliveira, Valéria de |
Publisher | Universidade Federal de Goiás, Programa de Pós-graduação em Fisica (IF), UFG, Brasil, Instituto de Física - IF (RG) |
Source Sets | IBICT Brazilian ETDs |
Language | Portuguese |
Detected Language | Portuguese |
Type | info:eu-repo/semantics/publishedVersion, info:eu-repo/semantics/doctoralThesis |
Format | application/pdf |
Source | reponame:Biblioteca Digital de Teses e Dissertações da UFG, instname:Universidade Federal de Goiás, instacron:UFG |
Rights | http://creativecommons.org/licenses/by-nc-nd/4.0/, info:eu-repo/semantics/openAccess |
Relation | 3162138865744262028, 600, 600, 600, 600, -4029658853652049306, 4652787352762697830, 2075167498588264571 |
Page generated in 0.0021 seconds