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Previous issue date: 2014-06-04 / Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior - CAPES / Cutaneous leishmaniasis is a neglected tropical disease that infects millions of
people worldwide, representing a serious public health problem. The miltefosine (MT) is an
alkylphospholipid that has been approved for the treatment of breast cancer metastasis and
visceral leishmaniasis, although the mechanism of action at the molecular level is poorly
understood. Electron paramagnetic resonance (EPR) spectroscopy of the lipid spin lebel
analog of stearic acid (5-DSA) and the maleimide derivative spin label (6-MSL) covalently
bound to membrane proteins showed that the MT causes a large increase in the molecular
dynamics of erythrocyte membranes (ghosts) and detergent resistant membranes (DRMs)
prepared from erythrocyte membranes. In the vesicles of lipid raft constituents, it was shown
that 20 mol% sphingomyelin could be replaced by 20 mol% MT with no change in the molecular
dynamics. Furthermore, the effect of MT on DRMs was more pronounced than in
erythrocyte ghosts, supporting the hypothesis that MT is a lipid raft modulator. At the reported
MT-plasma concentrations found during the treatment of leishmaniasis (31-52μg/mL),
our measurements in blood plasma indicated a hemolytic level of 2-5% and also showed
that the MT concentration that changes the erythrocyte membrane fluidity to an extent that
is detectable by EPR spectroscopy causes about 46% hemolysis. Subsequently, EPR studies
performed with the same spin labels in the membrane of Leishmania (L.) amazonensis
(promastigote) showed changes similar to those found in erythrocyte membranes. Cytotoxic
effects on the parasites were also evaluated to investigate the relationships between the
cytotoxic potential of MT and its ability to alter membrane fluidity. The EPR data showed
that the minimum concentration of MT required to cause a change in the parasite membrane
occurred near the values of MT concentration which inhibits 50 % of cell growth (IC50); thus,
there is a correlation between the cytotoxicity and changes in the membrane. Although these
III
membrane alterations can be detected using a spin-labeled lipid, our experimental results
indicated that MT interacts predominantly with the protein component of the membrane. Cell
lysis was also detected by analyzing the supernatants of centrifuged samples for the presence
of spin-labeled membrane fragments and cytoplasmic proteins. Using a method for
the rapid incorporation of MT into the membrane, these effects were measured immediately
after treatment under the same range of MT concentrations that cause cell growth inhibition.
Cytotoxicity, estimated via microscopic counting of living and dead cells, indicated ∼
70% cell death at the concentration of MT at which EPR spectroscopy detected a significant
change in membrane dynamics. After this initial impact on the number of viable parasites,
the processes of cell death and growth continued during the first 4 h of incubation. The EPR
spectra of spin-labeled membrane-bound proteins were consistent with more expanded and
solvent-exposed protein conformations, suggesting a detergent-like action. Thus, MT may
form micelle-like structures around polypeptide chains, and proteins with a higher hydrophobicity
may induce the penetration of hydrophilic groups of MT into the membrane, causing
its rupture. / A leishmaniose cut ˆanea ´e uma doenc¸a tropical negligenciada que afetamilh˜oes
de pessoas em todo mundo, representando um grave problema de sa´ude p´ublica. A miltefosina
(MT) ´e um alquilfosfolip´ıdio aprovado inicialmente para tratamento de cˆancer metast
´atico e tamb´em foi licenciada para o tratamento da leishmaniose visceral, embora seu
mecanismo de ac¸ ˜ao a n´ıvel molecular permanec¸a pouco compreendido. A espectroscopia
de ressonˆancia paramagn´etica eletr ˆonica (RPE) do marcador de spin lip´ıdico an´alogo
do ´acido este´arico (5-DSA) e do marcador de spin derivado do maleimido (6-MSL) ligado
covalentemente `as prote´ınas de membrana demonstraram que a MT provoca um grande
aumento na dinˆamica molecular das membranas de eritr ´ocito (ghosts) e membranas resistentes
`a extrac¸ ˜ao por detergente (DRMs) preparadas a partir de membranas de eritr ´ocito. A
t ´ecnica tamb´em demonstrou que em ves´ıculas formadas com lip´ıdios constituintes de rafts,
20 mol% de esfingomielina pode ser substitu´ıdo por 20 mol% de MT, sem qualquer alterac¸ ˜ao
em termos de dinˆamica molecular. Al ´em disso, o efeito da MT em DRMs foi mais pronunciado
do que em ghosts de eritr ´ocito, consistente com a hip´otese da MT ser um modulador
de raft. Na concentrac¸ ˜ao de MT presente no plasma sangu´ıneo durante o tratamento de
leishmaniose (31-52 μg/mL), as nossas medidas realizadas diretamente no sangue total
indicaram um n´ıvel de 2-5% de hem´olise e tamb´em mostrou que a concentrac¸ ˜ao de MT
capaz de alterar a fluidez da membrana de eritr ´ocito a n´ıvel detect ´avel pela espectroscopia
de RPE causou cerca de 46% de hem´olise. Posteriormente, estudos de RPE realizados
com os mesmos marcadores de spin na membrana de Leishmania (L.) amazonensis
(forma promastigota) demonstraram alterac¸ ˜oes similares `as encontradas nas membranas
de eritr ´ocito. Os efeitos citot ´oxicos sobre os parasitas tamb´em foram avaliados para investigar
as relac¸ ˜oes entre os potenciais citot ´oxicos da MT e sua capacidade de alterar
I
a fluidez da membrana. Os dados de RPE demonstraram que a concentrac¸ ˜ao m´ınima
necess´aria de MT para causar alterac¸ ˜ao na membrana do parasito ocorreu pr ´oximo dos
valores de concentrac¸ ˜ao que inibe 50% do crescimento celular (IC50), existindo, portanto,
uma correlac¸ ˜ao entre as alterac¸ ˜oes na membrana e a citotoxicidade. Embora o marcador
de spin lip´ıdico tamb´em tenha detectado alterac¸ ˜oes na fluidez da membrana, os experimentos
de RPE indicaram que a MT atua predominantemente no componente prot ´eico da
membrana. A lise celular tamb´em foi detectada atrav´es da an´alise dos sobrenadantes das
amostras centrifugadas onde foram encontrados fragmentos de membranas marcadas e
tamb´em prote´ınas citoplasm´aticas. Usando um m´etodo para a r ´apida incorporac¸ ˜ao da MT
na membrana, os efeitos de citotoxidade foram medidos imediatamente ap´os o tratamento
e na mesma faixa de concentrac¸ ˜oes de MT que causam a inibic¸ ˜ao do crescimento celular.
A citotoxicidade, estimada atrav´es da contagem microsc´opica das c´elulas vivas e mortas,
indicou ∼ 70% de morte celular na concentrac¸ ˜ao de MT em que a espectroscopia de RPE
detectou uma alterac¸ ˜ao significativa na dinˆamica da membrana. Ap´os o primeiro impacto
no n´umero de parasitas vi ´aveis, o processo de morte e crescimento celular continuou durante
as primeiras quatro horas de incubac¸ ˜ao. Os espectros de RPE de prote´ınas de membrana
marcadas com o 6-MSL foram consistentes com conformac¸ ˜oes de prote´ına mais
expandidas e expostas ao solvente, sugerindo uma ac¸ ˜ao t´ıpica dos detergentes. Nossa
interpretac¸ ˜ao ´e que a MT pode formar estruturas semelhantes das micelas ao redor das
cadeias polipept´ıdicas, expandindo as prote´ınas e que as prote´ınas com maior hidrofobicidade
poderiam induzir a penetrac¸ ˜ao de grupos hidrof´ılicos da MT no interior da membrana,
causando sua ruptura e consequentemente a morte da c´elula.
| Identifer | oai:union.ndltd.org:IBICT/oai:repositorio.bc.ufg.br:tede/3899 |
| Date | 04 June 2014 |
| Creators | Moreira, Rodrigo Alves |
| Contributors | Alonso, Antônio, Alonso, Antônio, Uliana, Silvia Reni Bortolin, Urbano, Ricardo Rodrigues, Loyola, Patrícia Resende Alo Nagib, Carvalho, Sheila Gonçalves do Couto |
| Publisher | Universidade Federal de Goiás, Programa de Pós-graduação em Fisica (IF), UFG, Brasil, Instituto de Física - IF (RG) |
| Source Sets | IBICT Brazilian ETDs |
| Language | Portuguese |
| Detected Language | English |
| Type | info:eu-repo/semantics/publishedVersion, info:eu-repo/semantics/doctoralThesis |
| Format | application/pdf |
| Source | reponame:Biblioteca Digital de Teses e Dissertações da UFG, instname:Universidade Federal de Goiás, instacron:UFG |
| Rights | info:eu-repo/semantics/openAccess |
| Relation | 3162138865744262028, 600, 600, 600, 600, -4029658853652049306, -8327146296503745929, 2075167498588264571 |
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