Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico e Tecnológico / In vitro cultured bovine embryos are susceptible to oxidative stress caused by
high oxygen concentration, that contributes to free radicals formation. Therefore,
antioxidant defense systems are needed to neutralize the reactive oxygen species
and their harmful effects. The aim of this study was to evaluate the addition of
different concentrations (100, 250 and 500μM) of ascorbic acid (AA) antioxidant to in
vitro maturation (IVM, 9 replications) or culture (IVC, 8 replications) media of bovine
embryos (Chapter 1). The concentration that provided greatest embryonic
development rate and better embryo quality was added to in vitro maturation and/or
culture media at different gaseous atmospheres (Chapter 2, 10 replications). Media
without antioxidant served as control-groups. Cumulus-oocyte complexes obtained
from bovine ovaries at the slaughterhouse were randomly distributed in groups and
matured in TCM-199 with addition of pFSH, bLH and 10% estrus cow serum (ECS),
for 22 to 24h, in an incubator at 39°C and 5% CO 2 in air and saturated humidity. The
in vitro production was performed using 20-40 oocytes/group in 400μL of medium in
4-well dishes (Chap. 1) and 13-32 oocytes/group in 200μL drops of medium under
mineral oil (Chap. 2). The in vitro fertilization (D0) was performed with Bos taurus
taurus frozen semen selected by Swim-up (Chap. 1) and Percoll gradient (Chap. 2)
with 1x106 spermatozoa/mL in TALP-Fert with heparin and PHE, for 18 to 22h, at the
same IVM conditions. The presumptive zygotes were in vitro cultured in SOFaaci
medium with 5% ECS under mineral oil, in the bag system at 5% CO2, 5% O2 and
90% N2 and saturated humidity (Chap. 1 and 2), or in an incubator at 5% CO2 in air
and saturated humidity (20% O2 in air; Chap 2). To analyze the percentage
of embryos on D2, D7 and D9 a randomized block delineation was used, having as
blockade criteria the collection day (Chap. 1). In Chap. 2, the cleavage rate on D2
was analyzed considering the effects of AA addition on maturation and culture and
the interaction between the two factors. The embryonic development data on D7 and
D9 were analyzed after arc sine square root transformation and considered the
effects of AA presence on maturation and culture, the gaseous atmosphere and the
interaction among these factors, taking into account the routine day in the analyses
model. Blastocyst cell number was obtained after base 10 logarithmic transformation
of data, using 8 (Chap. 1) and 10 replications (Chap. 2), with a significance level of
5%. In Chapter 1, the cleavage rate and embryonic development on D7 were similar
(P>0.05) among the different AA concentrations added to IVM or IVC. However, the
100μM AA addition to IVC tended (P<0.07) to show higher blastocyst production
(32.3%) when compared to the 500μM group (19.7%). The blastocyst production on
D9 increased significantly when 100μM AA were added to IVM (P<0.05) compared to
control-group (38.7 vs 29.0%), or on IVC (P<0.01) compared to 500μM concentration
(28.1 vs 14.1%). The blastocyst cell number was similar (P>0.05) among the different
AA concentrations and the control-group. In Chapter 2, there was no effect of
interaction (P>0.05) among the factors studied (AA on IVM, AA on IVC and
atmosphere of culture) on D2, D7 and D9. Cleavage rate and embryonic
development on D7 and D9 did not differ (P>0.05) between groups with and without
antioxidant addition, independently of the gaseous atmosphere. However, a greater
cell number was observed in hatched blastocysts (P<0.05) when the AA was
included in the culture medium. The results indicate that 100μM ascorbic acid
concentration can be used during IVM or IVC to increase embryo production,
especially on D9, and improve the quality of hatched blastocysts, independently of
the culture gaseous atmosphere. / Embriões bovinos cultivados in vitro são susceptíveis ao estresse oxidativo
causado pela alta concentração de oxigênio, que contribui para a formação de
radicais livres. Por isso, sistemas antioxidantes de defesa são necessários para
neutralizar as espécies reativas de oxigênio e seus efeitos prejudiciais. Este estudo
teve como objetivo avaliar a adição de diferentes concentrações (100, 250 e 500μM)
do antioxidante ácido ascórbico (AA) aos meios de maturação (MIV, 9 repetições) ou
cultivo (CIV, 8 repetições) in vitro de embriões bovinos (Capítulo 1). A concentração
que propiciou maior taxa de desenvolvimento embrionário e melhor qualidade dos
embriões foi adicionada aos meios de maturação e/ou cultivo in vitro em diferentes
atmosferas gasosas (Capítulo 2, 10 repetições). Meios sem antioxidante serviram
como grupos-controle. Complexos cumulus-oócitos obtidos de ovários de frigorífico
foram distribuídos aleatoriamente em grupos e maturados em TCM-199 adicionado
de pFSH, bLH e 10% de soro de vaca em estro (SVE), por 22 a 24h, em estufa a
39°C e 5% CO 2 em ar e umidade saturada. Para a produção in vitro foram utilizados
20-40 oócitos/grupo em 400μL de meio em placa de quatro poços (Cap. 1) e 13-32
oócitos/grupo em gotas de 200μL de meio sob óleo mineral (Cap. 2). A fecundação
in vitro (D0) foi conduzida com sêmen congelado Bos taurus taurus selecionado por
Swim-up (Cap. 1) e gradiente de Percoll (Cap. 2), com 1x106 espermatozóides/mL
em TALP-Fert com heparina e PHE, por 18 a 22h, nas mesmas condições da MIV.
Os prováveis zigotos foram cultivados in vitro em meio SOFaaci com 5% de SVE sob
óleo mineral, no sistema de bolsas gaseificadas (bag system) a 5% CO2, 5% O2 e
90% N2 e umidade saturada (Cap. 1 e 2), ou em estufa a 5% CO2 em ar e umidade
saturada (20% O2 em ar; Cap. 2). Para analisar a porcentagem de embriões no D2,
D7 e D9 utilizou-se o delineamento blocos ao acaso, tendo como critério de bloqueio
o dia da coleta (Cap. 1). No Cap. 2, para analisar a taxa de clivagem no D2 foram
considerados os efeitos da adição do AA na maturação, adição do AA no cultivo e a
interação entre os dois fatores. Os dados do desenvolvimento embrionário no D7 e
D9 foram analisados após transformação arcoseno raiz quadrada e foram
considerados os efeitos da presença do AA na maturação, presença do AA no
cultivo, a atmosfera gasosa e a interação entre esses fatores, considerando o dia de
realização da rotina no modelo de análise. Para contagem de células dos
blastocistos os dados foram analisados após transformação logarítmica de base 10,
sendo utilizadas 8 repetições (Cap. 1) e 10 repetições (Cap. 2), com nível de
significância de 5%. No Capítulo 1, a taxa de clivagem e o desenvolvimento
embrionário no D7 foram similares (P>0,05) entre as diferentes concentrações de AA
adicionadas na MIV ou CIV. Entretanto, a adição de 100μM de AA no CIV
apresentou tendência (P<0,07) de maior produção de blastocistos (32,3%) quando
comparado ao grupo com 500μM (19,7%). A produção de blastocistos no D9
aumentou significativamente quando 100μM de AA foi adicionado na MIV (P<0,05)
comparado ao grupo-controle (38,7 vs 29,0%), ou no CIV (P<0,01) comparado com
a concentração de 500μM (28,1 vs 14,1%). O número de células por blastocisto foi
similar (P>0,05) entre as diferentes concentrações de AA e o grupo-controle. No
Capítulo 2, não houve efeito da interação (P>0,05) entre os fatores estudados (AA
na MIV, AA no CIV e atmosfera de cultivo) sobre o D2, D7 e D9. A taxa de clivagem
e o desenvolvimento embrionário no D7 e D9 não diferiram (P>0,05) entre os grupos
com e sem antioxidante, independentemente da atmosfera gasosa. No entanto,
maior número de células foi observado nos blastocistos eclodidos (P<0,05) quando o
AA foi incluído no meio de cultivo. Os resultados indicam que a concentração de
100μM de ácido ascórbico pode ser utilizada durante a MIV ou CIV para incrementar
a produção embrionária, especialmente no D9, além de melhorar a qualidade dos
blastocistos eclodidos, independentemente da atmosfera gasosa de cultivo.
| Identifer | oai:union.ndltd.org:IBICT/oai:repositorio.ufsm.br:1/4072 |
| Date | 17 November 2008 |
| Creators | Pozzobon, Sandra Elisa |
| Contributors | Rubin, Mara Iolanda Batistella, Mattos, Rodrigo Costa, Brum, Daniela dos Santos, Brass, Karin Erica, Kurtz Filho, Mario |
| Publisher | Universidade Federal de Santa Maria, Programa de Pós-Graduação em Medicina Veterinária, UFSM, BR, Medicina Veterinária |
| Source Sets | IBICT Brazilian ETDs |
| Language | Portuguese |
| Detected Language | Portuguese |
| Type | info:eu-repo/semantics/publishedVersion, info:eu-repo/semantics/doctoralThesis |
| Format | application/pdf |
| Source | reponame:Repositório Institucional da UFSM, instname:Universidade Federal de Santa Maria, instacron:UFSM |
| Rights | info:eu-repo/semantics/openAccess |
| Relation | 500500000007, 400, 300, 300, 300, 300, 300, 300, 02a1a2f5-cf70-4065-ae1f-c6bba79e8848, ae3730f8-00e6-4c15-bbd1-6ba57ca9cf8b, b33356f0-fe24-48cd-8063-eb0aa1a15b47, cfcb20cc-f744-47a8-9bf6-2d2319da90fe, 576cb879-c72e-4050-87e7-12acfd4bb285, c8681efa-0876-4222-a0ec-7932543e17fc |
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