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Previous issue date: 2011 / Fundação Oswaldo Cruz. Instituto Oswaldo Cruz. Rio de Janeiro, RJ, Brasil / A resposta imune inata local ativada pelo patógeno, através do seu
reconhecimento por receptores como os toll-like (TLR), é determinante na
natureza da resposta imune adquirida gerada após a infecção. Neste contexto,
tem sido demonstrado que o reconhecimento do DNA micobacteriano rico em
motivos CpG não metilados pelo receptor TLR-9 representa uma via importante
na ativação da produção de IL-12 por celulas dendriticas favorecendo a
subseqüente geração de resposta imune Th1. As micobacterias expressam em
abundância uma proteína catiônica semelhante às histonas de outras bactérias,
denominada Hlp, presente tanto no envelope como no nucleóide bacteriano. A
Hlp localizada no envoltório micobacteriano tem sido implicada no processo de
adesão das micobacterias ao epitélio respiratório visto que interage com
proteoglicanas da superfície destas células. Por outro lado, foi mostrado que o
complexo Hlp-CpG ativa a sinalização celular via TLR-9, induzindo a produção
de mediadores inflamatórios em macrófagos in vitro e um aumento na
resistência à infecção por Mycobacterium tuberculosis in vivo. As micobacterias
penetram no hospedeiro através das vias aéreas superiores, e as células
epiteliais expressam receptores da imunidade inata, contribuindo para a
resposta imune inata local. Este trabalho teve como objetivo investigar a
capacidade da proteína Hlp de ativar, quando combinada ou não ao
oligonucleotideo sintético CpG, a resposta imune inata de células epiteliais
alveolares. Para atingir este objetivo, utilizamos a proteína Hlp recombinante
(rHlp) de M. bovis BCG. O complexo rHlp-oligonucleotideo CpG induziu uma
produção aproximadamente 2 vezes maior de interleucina 8 (IL-8) em relação
às células só estimuladas com CpG e de quase quatro vezes em relação aos
níveis observados com a célula só estimulada com rHlp, indicando um
sinergismo entre estes dois estímulos. Este mesmo efeito da Hlp sobre a CpG
foi observada em macrófagos, quando a produção do fator de necrose tumoral
alfa (TNFsintéticos
derivados da sequencia da Hlp compreendendo os sítios de ligação a
DNA e proteoglicanas, respectivamente, quanto à capacidade de mimetizar o
efeito imunoestimulador da proteína inteira. Estes ensaios confirmaram que a
presença de um sitio de ligação a DNA na molécula é essencial para sua
atividade imunoestimuladora sobre o CpG. Finalmente, quando passamos a
utilizar a micobacteria interia em vez da rHlp como estímulo, a adição de CpG
ao M. smegmatis selvagem, mas não mutante para o gene hlp, aumentou a
produção de IL-8 e RANTES pelas células epiteliais Os resultados descritos
acima indicam que as células epiteliais respiratórias podem reconhecer
micobacterias via TLR-9 e, assim, participar da resposta imune inata no sitio da
infecção. Dentro deste contexto, aliado ao fato de tratar-se de uma proteína
muito conservada encontrada em todas as micobactérias, a Hlp tem potencial
de, quando combinada a DNA, ser empregada tanto como um bom imunógeno,
assim como adjuvante em intervenções imunes contra as micobacterioses tais
como a vacinação intranasal. / The local innate immune response induced by a pathogen at the site of
infection, through its recognition by Toll-like receptors (TLRs), plays an
important role in modeling the subsequent acquired immune response. In this
context, it has been shown that recognition of mycobacterial DNA through its
unmethylated CpG motifs by TLR-9 represents an important pathway for the
production of IL-12 by dendritic cells favoring the subsequent generation of Th1
immune response. Mycobacteria express a major cationic histone-like protein
(Hlp), which is present in the cell envelope and in the bacterial nucleoid. The
bacterial surface-exposed Hlp has been implicated in mycobacterium adhesion
on respiratory epithelium due to the capacity of Hlp to interact with cell surface
proteoglycans. On the other hand, it has been shown that complexes of Hlp–
CpG oligonucleotide activate cell signaling through TLR-9, inducing the
production of inflammatory mediators in macrophages in vitro, and increasing
resistance to Mycobacterium tuberculosis infection in vivo. The major port of
entry of Mycobacteria in the host is the air way tract, and epithelial cells are
known to express receptors of innate immunity and participate of local innate
immune response. The objective of the present study was to investigate the
capacity of Hlp to activate an innate immune response in alveolar epithelial
cells. Cells were stimulated with M. bovis BCG recombinant Hlp (rHlp),
combined or not with CpG oligonucleotide. The Hlp-CpG complex induced
interleukin 8 (IL-8) production twice higher than the cell stimulated only with
CpG, and 4 times higher than the cell treated only with Hlp, indicating a
synergism between these two stimuli. The same effect was also observed in
macrophages when the production of tumor necrosis factor- (TNF- ) was
measured. We also tested the capacity of synthetic peptides displaying amino
acid sequences identical to the Hlp DNA and proteoglycan binding sites for their
ability to mimic the immune stimulatory effect of the whole protein. These
assays confirmed that the presence of a DNA-binding site in the molecule is
essential of its immune stimulating activity over CpG. Finally, the addition of
CpG to wild type M. smegmatis, but not to the mutant strain for the gene hlp,
increased the production of IL-8 and RANTES by epithelial cells. The results
described above indicate that respiratory epithelial cells can recognize
mycobacteria via TLR-9 and thus participate of the innate immune response at
the site of infection. These observations, in addition to the fact that Hlp is a very
conserved protein found in all mycobacteria, suggest that when combined with
DNA Hlp can be potentially used both as a good immunogen, as well as an
adjuvant, in immune interventions against mycobacteria such as intranasal
vaccination.
| Identifer | oai:union.ndltd.org:IBICT/oai:www.arca.fiocruz.br:icict/7056 |
| Date | January 2011 |
| Creators | Dias, André Alves |
| Contributors | Pereira, Geraldo Moura Batista, Pinto, Luzia Maria de Oliveira, Pereira, Verônica Schmitz, Machado, Alice de Miranda, Hirata Junior, Raphael, Pessolani, Maria Cristina Vidal |
| Source Sets | IBICT Brazilian ETDs |
| Language | Portuguese |
| Detected Language | English |
| Type | info:eu-repo/semantics/publishedVersion, info:eu-repo/semantics/masterThesis |
| Source | reponame:Repositório Institucional da FIOCRUZ, instname:Fundação Oswaldo Cruz, instacron:FIOCRUZ |
| Rights | info:eu-repo/semantics/openAccess |
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