In der heutigen chemisch-pharmazeutischen Industrie sind Biokatalysen nicht mehr wegzudenken. Abhängig von der zu realisierenden Biotransformation, wurden signifikante Limitationen vor allem bei der Umwandlung von hydrophoben Substraten identifiziert. Wässrige und organische Einphasenreaktionssysteme treffen hier sehr schnell an ihre Grenzen, sodass nur geringe Ausbeuten realisierbar sind. Eine Alternative stellen mehrphasige Reaktionssysteme dar, wobei hier grundlegend klassische 2-Phasensysteme und Emulsionen unterschieden werden können. Mit Hilfe dieser alternativen Systeme können die bereits genannten Limitationen überwunden werden. Pickering Emulsionen stellen einen Spezialfall der klassischen Tensid stabilisierten Emulsion dar, wobei hier Nano- und Mikropartikel als Stabilisatoren die Tenside an der Tröpfchengrenzfläche ersetzen.
Pickering Emulsionen stellen hoch dynamische Systeme dar und trotz kontinuierlicher Forschung auf diesem Gebiet bleiben bisher grundlegende Frage ungeklärt: Welche Parameter für bioaktive w/o Pickering Emulsionen wie Lösungsmittelkomposition, deren Phasenverhältnis, Partikelcharakteristika und -menge, Dispergierverfahren, als auch die Biokatalysatorkonzentration haben auf die Dispersität und Stabilität der Pickering Emulsionen den größten Effekt? Lässt sich eine Vielzahl von Biokatalysatoren in diesem Reaktionssystem einsetzen? Kurzum, eignen sich Wasser in Öl (w/o) Pickering Emulsionen als universelle Reaktionssysteme für effiziente Biokatalysen und stellen somit eine Plattformtechnologie dar?
In dieser Studie konnte gezeigt werden, nahezu alle organischen Lösungsmittel, insbesondere leicht wassermischbare Vertreter, können w/o Pickering Emulsionen ausbilden. Ebenso ist eine Stabilisierung sowohl durch Naturstoffpartikel als auch durch hydrophobe und hydrophile Silicon-Compositpartikel realisierbar. In einer umfassenden Charakterisierung der typischen Stellräder für Emulsionen wurden kommerziell erhältliche Lipasen als bioaktive Komponenten zugesetzt, da diese die meistgenutzten Biokatalysatoren in diesem System darstellen. Die Veränderungen der Emulsionsstabilität und Tröpfchengrößen, als Maß der Dispersität, wurden über 24 Stunden erfasst. Hierbei wurde ein maßgebender Einfluss der Proteinkomponente gegenüber allen anderen Parametern wie Partikelmenge, Phasenverhältnis und Dispersionsgeschwindigkeit festgestellt. Proteine mit ihrer amphiphilen Oberflächenbeschaffenheit sind somit nicht nur als Biokatalysatoren, sondern auch als zusätzliche Nanopartikel zu betrachten, die gemeinsam mit hydrophoben Partikeln einen synergetischen und normalisierenden Effekt auf Tröpfchengrößen und Emulsionsstabilität ausüben. Jedoch waren durch Proteinzugabe auch negative Effekte wie Nicht-Etablierung der Emulsion oder eine Phasenumkehr im zeitlichen Verlauf auslösbar, wenn eine Grenzkonzentration überschritten wurde.
Hinsichtlich der (bio)chemischen Charakterisierung von enzymbeladenen w/o Pickering Emulsionen konnte deutlich gezeigt werden, kleinere Tröpfchendurchmesser führen zu erhöhten Enzymaktivitäten und besseren Ausbeuten. Im moderat gerührten Batchreaktor wurde die volumetrische Raum-Zeit-Ausbeute um 500% bis 1100% gegenüber dem konventionellen 2 Phasen- und mikroaquatischen Reaktionssystem verbessert. Beim Einsatz von ganzen Zellen im Vergleich zum freien Enzym wurde mit normierter Biokatalysatoraktivität eine Verbesserung auf 130% bis 220% erzielt. Als beste Herstellungsmethodiken konnten das Dispergieren über Schütteln und Zahnkranzdispergierer ermittelt werden. Grenzflächentoxizität, als oft diskutierter Vorgang in Mehrphasensystemen, spielte auch in bioaktiven w/o Pickering Emulsionen eine wichtige Rolle. Es konnte gezeigt werden, hydrophilere Lösungsmittel, wie 2 Methyltetrahydrofuran, sorgten für eine minimierte Grenzflächendenaturierung der Proteine. Hingegen denaturierten hydrophobere Vertreter wie Cyclopentylmethylether und Cyclooctadien einen erheblichen Anteil des gelösten Proteins an der Grenzfläche. Eine eventuelle Kontamination der organischen Produktphase mit gentechnisch veränderten Enzymen durch assimiliertes Protein wurde ebenfalls untersucht. Es konnten geringe gelöste Proteinmengen festgestellt werden, wobei die Spannweite der gelösten Mengen 1 – 4% der Proteingesamtmenge betrug. Hydrophobere Lösungsmittel nahmen generell weniger Protein auf. Für die Evaluation der Verteilung von Substraten und Produkten zwischen beiden flüssigen und der festen Phase der Pickering Emulsion wurden exemplarisch das hydrophilste Substrat und das hydrophobste Produkt getestet. Es wurde keine signifikante Diffusion der gelösten Stoffe in die wässrige bzw. feste Phase ermittelt, insofern konnte eine dauerhaft hohe Bioverfügbarkeit der Substrate in der organischen Phase angenommen werden. Im gerührten Batch konnte eine Übertragung von Ionen zwischen den Dispersionströpfchen nur mit Hilfe von gelstabilisierten Dispersionströpfchen Einhalt geboten werden. Über derartige Modifikationen kann nun auch der Einsatz von mehreren Biokatalysatoren mit verschiedenen pH-Optima und Puffer-Präferenzen verwirklicht werden. Weiterhin konnte die disperse Phase auch gegen stark eutektische Lösungsmittel ausgetauscht werden, sodass Pickering Emulsionen auch als annähernd wasserfreie Reaktionssysteme nutzbar erschienen.
In der Risiko- und Anwendungsanalyse über drei Enzymklassen mit drei als „grüner“ klassifizierten Lösungsmitteln in abgestuften Hydrophobizitäten, erwies sich Cyclopentylmethylether als das Lösungsmittel der Wahl für die Etablierung bioaktiver w/o Pickering Emulsionen. Bei der Anwendung verschiedener Biokatalysator-Phänotypen in verschiedenen Reaktionssystemen und Lösungsmitteln, kristallisierten sich bioaktive w/o Pickering Emulsion in Cyclopentylmethylether als produktivstes System heraus. Jedoch wurden bei allen Versuchen inaktivierende Vorgänge auf die verschiedenen Biokatalysatoren beobachtet, wobei Enzyme mit einer augenscheinlichen Gleichverteilung von hydrophoben und hydrophilen Aminosäureresten auf ihrer Oberfläche deutlich bessere Ergebnisse zeigten. In der Anwendung von freiem Enzym und Ganzzell-Biokatalysator, bei normierter Gesamtaktivität, resultierten für den Einsatz in bioaktiven Pickering Emulsionen die ganzen Zellen als beste Biokatalysator-Formulierung. Es wurde signifikant höhere Produktivität sowie auch 300% kleinere Tröpfchen der dispergierten Phase erreicht. Die Modularisierung von Biokatalysen gegenüber One-Pot-Synthesen zeigte ebenfalls deutliche Vorteile in den Kennzahlen der durchgeführten Biotransformation, wobei der jeweilige Prozessschritt an den Biokatalysator angepasst und so ein Optimum an Effizienz erreicht werden kann. Auf diese Weise können biokatalytische Umwandlungen kombiniert werden, die sich im One-Pot-System durch Inhibierungen der angewandten Biokatalysatoren ausschließen würden.:Vorwort/ Danksagung I
Zusammenfassung III
Abstract VII
Liste der Publikationen XIV
Abkürzungsverzeichnis und Symbole XIV
1 Einleitung 1
1.1 Biokatalysatoren – Generelle Aspekte und spezielle Vertreter 1
1.2 Angewandte Biokatalyse in Ein-und Mehrphasen-Reaktionssystemen 6
1.3 Pickering Emulsionen - Stand der Technik 14
1.4 Zielstellung der Arbeit: Optimierte bioaktive w/o Pickering Emulsionen 16
2 Material & Methoden 17
2.1 Material 17
2.1.1 Geräte & Zubehör 17
2.1.2 Chemikalien & Kits 19
2.1.3 Puffer 21
2.1.4 Enzyme 22
2.2 Proteinchemische Methoden 22
2.2.1 Bestimmung der Proteinkonzentration - BCA-Test 22
2.2.2 Bestimmung der Proteingröße und -reinheit - SDS-Polyacrylamidgelelektro-
phorese (SDS – PAGE) 23
2.2.3 Photometrische Aktivitätsbestimmungen in wässrigem Milieu 24
2.2.4 Zusammenfassung Enzym-Charakteristika 27
2.3 w/o Pickering Emulsion – Essentielle Komponenten und Modifikationen 29
2.3.1 Definition des w/o PE-Standardsystems 29
2.3.2 Partikel zur Stabilisierung von w/o Pickering Emulsionen 29
2.3.3 Siliconbeschichtung von hydrophilen Partikeln und Bakterien 31
2.3.4 Bestimmung der Morphologie und Tröpfchengrößenverteilung 32
2.3.5 Lösungsmittelscreening 33
2.3.6 Phasen-Migration von Proteinen 34
2.3.7 Verteilungskoeffizienten von Substraten und Produkten im triphasischen
Reaktionssystem Pickering Emulsion 34
2.4 Biokatalyse in Pickering Emulsionen 35
2.4.1 Bioaktive w/o PE - Definition des Standard-Reaktionssystems 35
2.4.2 Biokompatibilität „grüner“ Lösungsmittel 36
2.4.3 GC – Analytik 38
2.5 Statistische Auswertung der Experimente 40
2.5.1 Gewichteter Mittelwert, interne und externe Konsistenz 40
2.5.2 Lösungsmittelscreening: statistische Auswertung 41
3 Ergebnisse und Diskussion 42
3.1 Modifizierung von Nano-, Mikro- und Naturstoffpartikeln durch Siliconbeschichtung
und Anwendungsscreening in w/o PE 42
3.1.1 Hydrophobizität der Silicon-Polymere 42
3.1.2 Morphologie von anorganischen Partikel-Materialien mit und ohne Silicon-
Beschichtung 43
3.1.3 Morphologie von Naturstoff-Partikeln mit und ohne Silicon-Beschichtung 47
3.1.4 Partikel-Aggregation und Gegenmaßnahmen 51
3.1.5 Partikel-Screening 53
3.2 Charakterisierung von w/o Pickering Emulsionen im gerührten Batch 59
3.2.1 Pickering Emulsionen in biokatalytisch relevanten organischen Lösungs-
mitteln 59
3.2.2 Bioaktive w/o PE - Auswirkung von Enzym – und Proteinmengen 66
3.2.3 Bioaktive w/o PE - Effekte der eingesetzten Partikelkonzentrationen 68
3.2.4 Bioaktive w/o PE - Einfluss der Phasenverhältnisse 70
3.2.5 Bioaktive w/o PE - Einfluss der angewandten Dispergiergeschwindigkeit 71
3.2.6 Bioaktive w/o PE - Herstellungsverfahren und Einfluss auf das Enzym 73
3.2.7 Vergleich 2-Phasensystem und bioaktive w/o Pickering Emulsion im
gerührten Batch 75
3.2.8 Tröpfchengröße und Einfluss auf Produktbildung des PE-Systems 77
3.2.9 Phasen-Migration von Proteinen - Evaluation von Enzymwechselwirkungen
mit dem Reaktionssystem 79
3.2.10 Verteilungskoeffizienten von Substraten und Produkten in den Standard–
Reaktionssystemen 81
3.2.11 Protonen-Transfer zwischen zwei dispergierten Phasen in w/o Pickering
Emulsionen 82
3.2.12 Alternative DES/o Pickering Emulsionen für wasserfreie Systeme 83
3.3 Bioaktive w/o Pickering Emulsion: Einschritt-Synthesen 84
3.3.1 Lipasenkatalysierte Umesterung in wässrigem Milieu 84
3.3.2 Carboligation mittels Benzaldehydlyase 86
3.3.3 Reduktionen via Alkoholdehydrogenasen 95
3.3.4 Transaminase 106
3.4 Bioaktive w/o Pickering Emulsionen: Mehrschritt-Synthesen 112
3.4.1 One-Pot-Biokatalyse gegen modularisierte Mehrschritt-Chemo-Biokatalyse 112
4 Bioaktive w/o Pickering Emulsionen als Reaktionssystem für Biokatalysen:
Zusammenfassung & Bewertung 117
5 Plattform w/o Pickering Emulsion: Schlussfolgerung und Ausblick 130
6 Literatur 131
Anhang 150
Versicherung 150
Abbildungsverzeichnis 151
Tabellenverzeichnis 158
Download Datensammlung 164
A3.1.5 TMODS-Silicat-NP-Benchmark 165
A3.2.1-1 Lösungsmittel-Screening: physiko-chemische Eigenschaften 167
A3.2.1-2 Regressionsanalyse: Qualität PE gegen alle physiko-chemischen Eigenschaften 171
A3.2.1-3 Optimierte Regressionsanalyse: Qualität PE gegen Molekulargewicht, Dichte
und Dampfdruck 173
A3.2.3 Auswirkungen von Protein- und Enzymmengen 175
A3.2.4 Effekte der eingesetzten Partikelmengen 175
A3.2.5 Einfluss der Phasenverhältnisse 176
A3.2.6 Einfluss der angewandten Dispersionsgeschwindigkeit/ -energie 176
A3.3.1 Lipasenkatalysierte Umesterung 177
| Identifer | oai:union.ndltd.org:DRESDEN/oai:qucosa:de:qucosa:75585 |
| Date | 02 August 2021 |
| Creators | Plikat, Christoph |
| Contributors | Ansorge-Schumacher, Marion, Drews, Anja, Technische Universität Dresden |
| Source Sets | Hochschulschriftenserver (HSSS) der SLUB Dresden |
| Language | German |
| Detected Language | German |
| Type | info:eu-repo/semantics/publishedVersion, doc-type:doctoralThesis, info:eu-repo/semantics/doctoralThesis, doc-type:Text |
| Rights | info:eu-repo/semantics/openAccess |
| Relation | info:eu-repo/grantAgreement/Bundesministerium für Bildung und Forschung/5 Jahre/031A163B//Modularisierte mehrphasige Biokatalyse mit enzymatisch aktiven w/o Pickering Emulsionen im Membranreaktor (BioPICK)/BioPICK |
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