Les synapses sont des structures fortement compartimentées remplies de complexes de protéines intéragissant entre elles. La fente synaptique reliant les compartiments pré- et post-synaptiques est une zone adhésive de 20 nm d'épaisseur, contenant des protéines d'adhésion et des récepteurs neurotransmetteurs. Les progrès dans l'imagerie à haute résolution offrent une vision améliorée de l'organisation dynamique des protéines synaptiques. Cependant, une évaluation quantitative de la concentration et du niveau d'oligomérisation de ces complexes reste difficile. Ceci est en partie dû au fait que les méthodes traditionnelles d'identification des récepteurs s'appuient sur des anticorps, dont la taille relativement grande (~ 15 nm) peut conduire à un empêchement stérique et un biais de localisation, alors que leur divalence provoque une réticulation des protéines. Ici, nous avons étudié l'impact de la valence de la sonde et des récepteurs sur la diffusion et l'organisation de 3 protéines synaptiques : Neurexin1β, neuroligine1 et la sous-unité du récepteur kainate GluK2. Nous avons utilisé une technique de single molecule pull down pour caractériser la composition de la sous-unité de ces protéines en observant des protéines possédant un tag GFP immobilisées sur un subtrat en utilisant une illumination TIRF. La neurexin1β présente essentiellement un step de photoblanchiment, tandis que la neuroligine1 présente principalement 2 steps, et GluK2 montre plusieurs steps, confirmant que ces protéines se rassemblent respectivement en monomères, dimères et tétramères. Ensuite, nous avons utilisé le FRAP pour surveiller la diffusion membranaire des 3 protéines marquées avec des sondes de valence différente. Nous avons étiqueté des protéines recombinantes portant un marqueur N-terminal biotinylé avec une streptavidine monovalente, divalente ou tétravalente (ou avec un anticorps anti-biotine), tous conjugués aux mêmes fluorophore organiques. Nous avons également utilisé une technique de STORM pour caractériser le niveau d'agrégation des 3 protéines en réponse aux différentes sondes. Nous montrons des effets drastiques en fonction de la nature de la protéine utilisée et de la valence de la sonde, suggérant que la diffusion est ralentie par l'agrégation des récepteurs, mettant ainsi en évidence les enjeux cruciaux dans les stratégies d'étiquetage, en particulier dans des espaces confinés tels que les synapses / Synapses are highly compartmentalized structures packed with interacting protein complexes. The synaptic cleft bridging pre- and post-synaptic compartments is an adhesive zone ~20 nm thick, containing adhesion proteins and neurotransmitter receptors. Progress in super-resolution imaging offers an improved view of the dynamical organization of synaptic proteins. However, a quantitative assessment of the concentration and oligomerization level of those complexes remains difficult. This is in part because traditional ways to label receptors rely on antibodies, whose relatively large size (~15 nm) may lead to steric hindrance and localization bias, while their divalence causes protein cross-linking. Here, we studied the impact of probe and receptor valence on the diffusion and organization of 3 synaptic proteins: neurexin1β, neuroligin1, and the GluK2 kainate receptor subunit. We used single molecule pull-down to characterize the subunit composition of those proteins, by observing immobilized GFP-tagged proteins under TIRF illumination. Neurexin1β shows essentially 1 photo-bleaching step, while neuroligin1 exhibits mostly 2 steps, and GluK2 shows multiple steps, confirming that those proteins assemble into monomers, dimers, and tetramers, respectively. Then, we used FRAP to monitor the surface diffusion of the 3 proteins labeled with probes of different valence. We labeled recombinant proteins carrying a biotinylated N-terminal tag with monomeric, dimeric, or tetrameric streptavidin (or with biotin antibody), all conjugated to the same organic dyes. We also used STORM to characterize the aggregation level of the 3 proteins in response to the different probes. We show drastic effects depending on the nature of the protein used and the probe valence, suggesting that diffusion is slowed down by receptor aggregation, thereby highlighting the crucial issues at stake in labelling strategies, especially in confined spaces such as synapses.
| Identifer | oai:union.ndltd.org:theses.fr/2018BORD0243 |
| Date | 29 November 2018 |
| Creators | Saphy, Camille |
| Contributors | Bordeaux, Thoumine, Olivier |
| Source Sets | Dépôt national des thèses électroniques françaises |
| Language | English |
| Detected Language | French |
| Type | Electronic Thesis or Dissertation, Text |
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