Orientadores: Antonia Paula Marques de Faria, Maricilda Palandi de Mello / Dissertação (mestrado) - Universidade Estadual de Campinas, Faculdade de Ciencias Medicas / Made available in DSpace on 2018-08-13T16:41:43Z (GMT). No. of bitstreams: 1
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Previous issue date: 2009 / Resumo: A deficiência mental (DM) corresponde a uma das categorias mais amplas de distúrbios, acometendo de 1% a 3% da população nos países industrializados, enquanto nos países em desenvolvimento estima-se prevalência cerca de três vezes maior. Devido à heterogeneidade de fatores causais associados a essa condição, sua investigação diagnóstica pode ser complexa e 40% dos casos não têm sua origem determinada. Recentemente, foi demonstrado que rearranjos subteloméricos são responsáveis por 5% a 7% dos casos de DM idiopática. Entre as técnicas mais promissoras para a identificação dessas alterações, está a Multiplex Ligationdependent Probe Amplification (MLPA), que possibilita a quantificação relativa, quanto ao número de cópias, de mais de 50 sequências de ácidos nucléicos em um único experimento, sendo capaz de detectar deleções e duplicações de diversos genes, além de mutações de ponto conhecidas. É baseada na hibridização do DNA genômico a uma mistura de sondas específicas para cada região estudada, com amplificação dos produtos de ligação pela técnica de PCR, utilizando um par de primers universal. A visualização dessas amplificações pode ser feita por eletroforese capilar e a análise por programas específicos de genotipagem. Entre as vantagens do método estão o custo relativamente baixo, simplicidade, rapidez e sensibilidade, justificando a implantação em serviços direcionados para o estudo da etiologia da DM. Assim, o propósito deste trabalho foi implantar o método em nosso laboratório, utilizando o kit SALSA MLPA P036 HUMAN TELOMERE para pesquisa de rearranjos subteloméricos em indivíduos com DM idiopática. Na padronização, foram empregados controles com e sem alteração subtelomérica, sendo avaliados os parâmetros de tempo de estocagem das reações em refrigerador; quantidade de DNA utilizado em cada reação; forma de normalização dos dados, e possibilidade de redução do volume das soluções empregadas para metade ou dois terços do preconizado no protocolo original, cujo volume final de reação é de 50 µL, dos quais somente 0,75 µL são utilizados na eletroforese capilar, com descarte do restante. A análise dos resultados, confirmados pela utilização de controles com e alterações subteloméricas, mostrou que a implantação do método foi bem-sucedida. Além disso, foi verificado que o tempo máximo de estocagem das reações em refrigerador sem prejuízo dos resultados é de aproximadamente três meses; que a quantidade de DNA satisfatória para o procedimento está entre 150-250 ng por reação; que não é aconselhável a utilização de protocolos com volumes reduzidos, pois a análise de reações realizadas dessa forma mostrou resultados falso-positivos quando comparados às reações feitas segundo o protocolo original; que a forma de normalização dos dados mais adequada para a análise dos resultados é a combinação dos programas GeneScan®, Genotyper® e planilha específica para cada kit ao invés do programa Coffalyser®, indicado pelo fabricante do produto. Após essa padronização, o método foi aplicado no estudo de 62 indivíduos com atraso do desenvolvimento ou DM de causa indeterminada, sendo identificadas alterações em seis deles. Duas foram constatadas também pelo kit de confirmação SALSA MLPA P070, sendo uma del(1p36) e outra um rearranjo del(5p)/dup(9p), ambas validadas pela análise por FISH. As quatro restantes [del(12p)] não foram observadas pelo kit de confirmação, sendo realizado sequenciamento automático que identificou o SNP (rs60220187). Concluindo, a técnica de MLPA foi implantada com sucesso, mostrando-se adequada e eficiente para a investigação de rearranjos subteloméricos. / Abstract: Mental retardation (MR) is the most frequent disability and affects 1% to 3% of general population in industrialized world, while in developing countries it is considered to be three times higher. The etiology is heterogeneous and includes multiple genetic and environmental factors, although in about 40% of the cases its cause remains undetermined. Recently, several studies suggest that chromosomal rearrangements involving subtelomeric regions are common causes of idiopathic MR and occur in approximately 5% to 7% of patients. The Multiplex Ligationdependent Probe Amplification (MLPA) technique has been proposed as one of the alternatives to identify these abnormalities. It is based on hybridization of genomic DNA to a mixture of standardized probes for each region studied. All of the probe ligation products are amplified by PCR using only one universal primer pair. Separation and visualization of the fragments can be developed and the analysis by means of specific softwares for genotyping. Relatively low cost, simplicity and sensitivity are among the advantages of this method, which has been considered as an alternative for diagnostic screening of individuals with undetermined MR or developmental delay. The present study aimed to implement this technique in our laboratory, using the SALSA MLPA P036 human telomere test kit for detecting subtelomeric rearrangements in idiopathic MR patients evaluated in our service. For validation study, eleven normal controls and two positive controls were utilized, as well as the following parameters were evaluated: period of storage of reaction, amount of DNA used for each reaction, procedures to data normalization and reduction of reaction volume. The validation was successful; in addition, it was verified that maximum period for storage of reaction was about three months; adequate amount of DNA for each reaction was approximately 150ng-250 ng;
Reduction in volume reaction produced false-positive results; the more suitable method for data normalization was a combination of GeneScan®, Genotyper® softwares and a the use of a specific Microsoft Excel® spreadsheet for each kit, instead of the Coffalyser® program, recommended by the manufacturer. After validation, a pilot study was carried out with 62 patients considered as idiopathic MR using initially the SALSA MLPA P036 kit. MLPA analyses have indicated abnormal copy number in six patients. SALSA MLPA P070 kit confirmed 2 out of the 6 alterations: a 1p36 deletion and a 5p deletion / 9p duplication rearrangement, which were validated by FISH analysis. Other four alterations corresponded to a same 12p deletion, which was not further confirmed. Sequencing the correspondent fragment a known as SNP rs60220187 was identified. In conclusion, we demonstrated that MLPA is an appropriate and efficient technique and should be considered as a routine screening in the evaluation of individuals with unexplained mental retardation or developmental delay. / Mestrado / Ciencias Biomedicas / Mestre em Ciências Médicas
| Identifer | oai:union.ndltd.org:IBICT/oai:repositorio.unicamp.br:REPOSIP/308256 |
| Date | 13 August 2018 |
| Creators | Lincoln-de-Carvalho, Carolina Rodrigues |
| Contributors | UNIVERSIDADE ESTADUAL DE CAMPINAS, Mello, Maricilda Palandi de, Faria, Antonia Paula Marques de, 1957-, Perez, Beatriz Alvarez, Sartorato, Edi Lúcia |
| Publisher | [s.n.], Universidade Estadual de Campinas. Faculdade de Ciências Médicas, Programa de Pós-Graduação em Ciências Médicas |
| Source Sets | IBICT Brazilian ETDs |
| Language | Portuguese |
| Detected Language | Portuguese |
| Type | info:eu-repo/semantics/publishedVersion, info:eu-repo/semantics/masterThesis |
| Format | 211 p. : il., application/pdf |
| Source | reponame:Repositório Institucional da Unicamp, instname:Universidade Estadual de Campinas, instacron:UNICAMP |
| Rights | info:eu-repo/semantics/openAccess |
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