A crescente resistência dos micro-organismos patogênicos aos fármacos já existentes gera intensa demanda por novos agentes terapêuticos. Em contrapartida, a eficiência na descoberta de compostos com novas estruturas químicas diminuiu nos últimos anos. Tendo em vista a vasta biodiversidade existente de micro-organismos, a redução da eficiência na descoberta de novos produtos naturais não indica que todos compostos existentes já foram descritos, mas sim que as metodologias para isolamento dos mesmos devem ser aperfeiçoadas e diversificadas, e novos nichos devem ser explorados. Esta tese compreende três capítulos, que trazem abordagens que podem ser utilizadas na busca por produtos naturais. O capítulo 1 aborda a aplicação de conhecimentos de biologia molecular na pesquisa de produtos naturais, através da metagenômica. O capítulo 2 aborda o conceito de química ecológica para estimular o metabolismo secundário, através da utilização de interações microbianas. O capítulo 3 aborda o uso de genome mining para entender a capacidade metabólica de uma linhagem bacteriana, bem como o uso de variações nos parâmetros da cultura para alterar o metabolismo desta. Metagenômica: a triagem anti-parasitária das bibliotecas metagenômicas detectou clones bioativos contra Leishmania major. As análises químicas e biológicas das culturas destes clones não permitiram a identificação dos compostos responsáveis pelas atividades observadas. Esta abordagem apresenta grandes desafios técnicos e tem passado por ajustes envolvendo sequenciamento e bioinformática para aumentar a taxa de sucesso em seu uso. Interações microbianas: esta metodologia mostrou-se promissora para a busca por compostos bioativos, tendo em vista que diversos pares exibiram nova atividade antibiótica, corroborando a hipótese que interações microbianas podem levar à expressão diferenciada do metabolismo secundário. Foi escolhida para caracterização química e biológica a interação entre uma actinobactéria rara (Krasilnikovia sp. T082) e uma actinobactéria endossimbionte de besouro (Streptomyces sp. SPB78). Esta interação é robusta e estimula a biossíntese de um antibiótico polar capaz de inibir o crescimento de uma bactéria multirresistente. Diversas técnicas foram testadas para o isolamento do composto indutor e do antibiótico induzido. Este processo foi desafiador devido ao caráter polar de ambos compostos e pelo fato da atividade antibiótica ser instável. Foi demonstrado que o antibiótico induzido é capaz de inibir o crescimento do micro-organismo indutor, sugerindo importância ecológica deste composto. A utilização desta abordagem metodológica permitiu a identificação de uma linhagem pertencente a um gênero de actinobactéria rara que nunca teve seu metabolismo secundário estudado (Krasilnikovia). Isto foi realizado através da investigação de seu genoma e também através do isolamento de compostos produzidos por esta linhagem. Esta linhagem demonstrou potencial para a produção de metabólitos secundários, apresentando pelo menos 21 potenciais clusters gênicos biossintéticos detectados pelo antiSMASH em seu genoma. Esta linhagem foi cultivada em dois meios de cultura (ISP2 e TSB) e diferentes metodologias de extração foram empregadas. O metabolismo secundário desta linhagem é expresso de maneira diferente de acordo com a metodologia de cultivo, evidenciando a importância da variação da composição do meio de cultura para o acesso da real capacidade metabólica de microorganismos. Foram identificadas algumas dicetopiperazinas, que são conhecidas por seu amplo espectro de atividades biológicas, e três compostos pertencentes a uma classe de peptídeos nãoribossomais não usuais com atividade antibiótica, que possuem estrutura química complexa e incomum para produtos naturais / Increasing drug resistance among microbial pathogens is a public health threat; therefore, new antibiotics are needed. On the other hand, the rate of discovering new compounds has diminished. Considering the wide biodiversity of microorganisms, reduced efficiency on the discovery of new natural products does not indicate that all existing compounds have been described, but that methods for isolation should be improved and diversified and new niches should be explored. This thesis comprises three chapters that demonstrate approaches that can be used in the search for natural products. Chapter 1 demonstrates the application of molecular biology tools on the search for natural products through metagenomics. Chapter 2 discusses the concept of chemical ecology for the stimulation of secondary metabolism by the use of microbial interactions. Chapter 3 discusses the use of genome mining to understand the metabolic capacity of a bacterial strain as well as the use of different culture parameters to alter bacterial metabolism. The anti-parasitic metagenomic screening on metagenomic libraries detected bioactive clones against L. major. Chemical and biological analysis of cultures of these clones did not permit identifying the compounds responsible for the observed activities. This approach faces diverse technical challenges and is currently being improved by the use of sequencing and bioinformatics analysis in order to increase its hit rate. Microbial interactions: this approach has shown to be promising in the search for bioactive compounds, considering that several pairs exhibited new antibiotic activity, supporting the hypothesis that microbial interactions can stimulate differential expression of secondary metabolism. It was chosen for chemical and biological characterization the interaction between a rare actinobacteria (Krasilnikovia sp. T082), which belongs to a genus that its secondary metabolism has not yet been studied in the literature, and an endosymbiont actinobacteria of beetle (Streptomyces sp. SPB78). This interaction is robust and stimulates the biosynthesis of a polar antibiotic capable of inhibiting the growth of multi-resistant bacteria. Several techniques have been tested for the isolation process of the inducer compound and the induced antibiotic. This process has been particularly challenging due to the polar character of both compounds, and because the antibiotic activity is unstable. It has been shown that the induced antibiotic is capable of inhibiting the growth of the inducer microorganism, suggesting an ecological importance of this compound. The use of this co-culture approach led to the identification of a strain belonging to a rare actinobacteria genus whose secondary metabolism has never been studied before (Krasilnikovia). This was accomplished through sequencing and analysis of its genome and also by isolating compounds produced by this strain (chapter 3). This strain has shown great potential for the production of secondary metabolites, exhibiting at least 21 biosynthetic gene clusters detected by antiSMASH in its genome, and only four of them showed high similarity to any known gene cluster. This strain was cultured in two different culture media (ISP2 and TSB), and different methods of extraction were used. The secondary metabolism of this strain is expressed differently according to the method of cultivation, showing the importance of variation in the composition of the culture medium to access the actual metabolic capacity of microorganisms. Some diketopiperazine were isolated, which are known for their wide spectrum of biological activities, and also three compounds belonging to a class of non-ribosomal peptides known for their high bioactivity, which have complex and unusual chemical structures for natural products
| Identifer | oai:union.ndltd.org:usp.br/oai:teses.usp.br:tde-04052017-112239 |
| Date | 09 December 2016 |
| Creators | Pessotti, Rita de Cássia |
| Contributors | Pupo, Monica Tallarico |
| Publisher | Biblioteca Digitais de Teses e Dissertações da USP |
| Source Sets | Universidade de São Paulo |
| Language | Portuguese |
| Detected Language | English |
| Type | Tese de Doutorado |
| Format | application/pdf |
| Rights | Reter o conteúdo por motivos de patente, publicação e/ou direitos autoriais. |
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