Skeletal development requires stringent control of programs for gene activation and suppression in response to physiological cues. There has been a principal focus on the identification of the mechanisms by which a particular cell phenotype is activated. MicroRNAs (miRNAs, miRs) have emerged as key negative regulators of diverse biological and pathological processes, including developmental timing, organogenesis, apoptosis, cell proliferation and differentiation; how they regulate osteoblast specific gene expression, is poorly understood. miRNAs are small 22 nucleotides (nt) endogenous non-coding RNAs (ncRNAs) that anneal to 3’ untranslated region (3’UTR) of target messenger RNA (mRNA) to mediate inhibition of translation and lower protein level. It remains to be established how specific miRNAs contribute to regulate the onset of a tissue-specific phenotype.
One previously identified important player in the activation of skeletal-related genes that control formation of bone tissue is Wnt (wingless) signaling. The Wnts are regulating the differentiation of multiple cell types but also are driving embryonic stem cells (ESCs) into specific lineages, for example they support osteoblastogenesis. By attaching to the membrane, Wnts direct a signaling cascade for accumulation of β-catenin (CatnB), which in turn activates osteoblast-essential genes. The contribution of global mechanisms is equally important for understanding tissue development and diseases.
The aim of this study was to identify miRNAs that are differentially expressed in osteogenically differentiated ESCs. In addition, functional characterization of these miRNAs was performed to further unravel the molecular mechanisms underlying osteogenesis. Finally, an important goal was to identify the mRNA targets of these miRNAs, which are required for differentiation of ESCs into osteoblasts with a primary focus on mRNAs associated with the Wnt signaling pathway.
miRNA expression profiling reveals an overall down-regulation of miRNAs during osteogenic differentiation of ESCs
To identify miRNAs that are potentially involved in osteogenesis ESCs were differentiated into osteoblasts and compared to undifferentiated ESCs using a miRNA microarray. miRNA profiling during the initial stages of osteoblast differentiation showed 25 miRNAs significantly differentially expressed. Differential expression of 4 miRNAs tested was confirmed using quantitative real-time PCR (RT-qPCR). Many miRNAs were expressed at low levels in differentiated ESCs. Indeed, down-regulation of miRNAs appeared to be common during differentiation. Furthermore, related miRNAs encoded on the same chromosome showed similar expression profiles. In summary, though several miRNAs were identified that can significantly distinguish between undifferentiated and osteogenically differentiated ESCs, 11 were chosen for further functional analysis.
Functional studies show that miR-127, miR-183, miR-291b-5p, miR-293, miR-361, miR-467b and miR-665 affect osteogenesis of ESCs
Undifferentiated and differentiated ESCs were used for functional studies of 11 miRNAs (miR-22, miR-127, miR-130a, miR-183, miR-291b-5p, miR-293, miR-300, miR-361, miR-467b, miR-665 and miR-690), which were down-regulated during osteogenic differentiation. To asses the function of these miRNAs, gain- and loss-of-function experiments were performed. Overexpressing and knocking down these miRNAs caused changes in cell survival, cell morphology, and osteogenic differentiation capacity as measured with calcium deposition, ALP activity and expression of osteogenic markers. Particularly, overexpression of miR-361 and knockdown of miR-665 significantly enhanced mineralization and expression levels of osteogenic markers. Thus, both miRNAs might regulate osteogenic differentiation in the early stages of lineage specification and commitment.
miRNAs are modulators of osteogenic differentiation
To identify miRNA target candidates that may account for the observed effects on cell survival and osteogenic differentiation of ESCs, a combined approach of bioinformatic predictions, mRNA expression analysis, and TurboGFP reduction upon miRNA overexpression coupled with the search of known literature was performed to identify cellular events that the identified miRNAs might be involved in.
Target identification suggested that the candidate miRNAs may interfere with the Wnt pathway as many target candidates were detected that were known to be Wnt signaling-associated. To confirm that miR-183, miR-293, miR-361, miR-665 and miR-690 regulated osteoblast differentiation, target mRNA/miRNA interaction was studied using RT-qPCR. Overexpression of these miRNAs reduced the levels of the key factors involved in Wnt signaling; particularly Wnt inhibitor factor 1 (WIF-1) levels were decreased by miR-293, nuclear factor of activated T cells 3 (NFATc-3) and Prickle-1 by miR-361, Dishevelled 1 (Dvl-1) by miR-665 and for forkhead box O 3 (FoxO-3), Ras homolog gene family, member A (RhoA) and CatnB-1 by miR-690.
Thus, to address the hypothesis that miR-361 activates osteoblast differentiation by targeting Prickle-1 and NFATc-3, the p2FP-RNAi vector system was applied. It was shown that expression of miR-361 down-regulates Prickle-1 levels, which to our knowledge have not been described so far. As it was found previously, Prickle-1 reduced Dvl-3 levels by promoting its ubiquitination, resulting in inhibition of Wnt canonical signaling in liver cancer. Since Dvls are positive regulators of osteogenesis by elevating CatnB levels and stimulating lymphoid enhancer factor/T cell factor proteins (LEF/TCF) -dependent transcription in the canonical Wnt pathway, Prickle-1 might be a negative regulator of osteogenic differentiation by eliminating Dvls from the complex. This interaction offers a novel mechanism of Wnt signaling activation in osteogenesis and can be explored to identify key components in the Wnt signaling pathway.
In summary, we suggested that miR-361 acts as an activator in osteogenic differentiation of ESCs. / Die Embryonalentwicklung des Skelettsystems ist in Bezug auf programmierte Genaktivierung in Antwort auf physiologische Schlüsselreize strikten Kontrollen unterworfen. Studien zur Untersuchung solcher Kontrollelemente haben sich dabei vor allem auf die Identifikation von Mechanismen fokussiert, die einen bestimmten zellulären Phänotyp aktivieren. Zum Vorschein kamen microRNAs (miRNAs), die als negative Schlüsselregulatoren diverser biologischer und pathologischer Prozesse wirken, wie zum Beispiel der zeitlichen Regulation von Entwicklung, der Organogenese, Apoptose, zellulärer Proliferation und Differenzierung. Wie sie allerdings die Osteogenese, den Prozess der Knochenbildung, regulieren ist weitestgehend unbekannt.
MiRNAs sind kurze 22 Nukleotid lange endogene nicht-kodierende RNAs (ncRNAs), die an die 3\' nicht translatierte Region (3\'UTR) einer Ziel mRNA binden und somit die Inhibition der Translation vermitteln, was letzten Endes zu einer Erniedrigung des Proteinlevels führt. Es bleibt allerdings zu etablieren, wie spezifische miRNAs zur Spezifikation in einen bestimmten Zell- oder Gewebephänotyps beitragen.
Einer der bisher identifizierten Akteure, der die Aktivierung von skelettalen Genen kontrolliert, ist der Wnt (wingless) Signalweg. Wnt Moleküle regulieren die Differenzierung vieler unterschiedlicher Zelltypen, aber lenken auch die Differenzierung von embryonalen Stammzellen (ESCs) in spezifische Richtungen, so z.B. in die Richtung von Knochenzellen, den Osteoblasten. Indem sie an die Zellmembran andocken, dirigieren Wnts eine Signalkaskade, die die Akkumulation von beta-catenin (CatnB) im Zellkern nach sich zieht, wodurch knochenspezifische Gene aktiviert werden. Obwohl die Wnt Signalkaskade weitestgehend beschrieben ist, ist der Beitrag globalerer Regulationsmechanismen, wie die der miRNAs, an der Osteogenese jedoch gleichfalls für das Verständnis von Gewebeentwicklung und -fehlfunktion von Bedeutung.
Das Ziel dieser Arbeit war es deshalb bestimmte miRNAs zu identifizieren, die differentiell in ESCs exprimiert werden, die zu Knochenzellen ausdifferenzieren. Desweiteren sollten diese miRNAs funktionell charakterisiert werden, um die molekularen Mechanismen, die der Osteogenese unterliegen, aufzudecken. Letztendlich war es ein weiteres wichtiges Ziel die Ziel mRNAs der knochenspezifischen miRNAs zu identifizieren und deren Bezug zum Wnt Signalweg zu charakterisieren.
miRNA Expression ist während der osteogenen Differenzierung herunter reguliert
Um solche miRNAs zu identifizieren, die potentiell in die Osteogenese eingreifen, wurden ESCs zu Osteoblasten differenziert und mit undifferenzierten ESCs mit Hilfe eines miRNA Microarrays verglichen. Das so durchgeführte miRNA Profiling zeigte, dass 25 miRNAs während der initialen Phase der osteogenen Differenzierung signifikant unterschiedlich exprimiert wurden. Die differentielle Expression von 4 getesteten miRNAs wurde in einem nächsten Schritt über quantitative real-time PCR (RT-qPCR) beispielhaft bestätigt. Generell zeigte sich, dass differenzierende ESCs viele miRNAs auf geringem Niveau exprimieren. Tatsächlich schien die Herunterregulation der miRNA Expression mit der Differenzierung der Zellen einherzugehen. Desweiteren zeigten miRNAs, die auf dem gleichen Chromosom kodiert sind, ähnliche Expressionsmuster. Zusammenfassend fanden sich etliche miRNAs, die in undifferenzierten Zellen im Vergleich zu differenzierenden Zellen unterschiedlich exprimiert werden, von denen schlussendlich 11 für weitere Analysen ausgewählt wurden (miR-22, miR-127, miR-130a, miR-183, miR-291b-5p, miR-293, miR-300, miR-361, miR-467b, miR-665 and miR-690).
miR-127, miR-183, miR-291b-5p, miR-293, miR-361, miR-467b und miR-665 beeinflussen die Osteogenese
In einem nächsten Schritt wurden undifferenzierte und differenzierende ESCs für funktionelle Studien dieser 11 herrunterregulierten miRNAs herangezogen. Um die Funktion dieser miRNAs aufzudecken, wurden sogenannte Gain-of-function und Loss-of-function Studien durchgeführt. Die experimentelle Überexpression und der Knock-down dieser miRNAs führten zu Änderungen in der zellulären Morphologie, der Viabilität und der osteogenen Differenzierungskapazität wie durch einen Kalziumdepositionsassay, einen ALP Aktivitätsassay und die Expression knochenspezifischer Markergene gezeigt werden konnte. Im Besonderen erhöhte die Überexpression der miR-361 und der Knock-down der miR-665 den Mineralisierungsgrad der Zellen und die Expressionniveaus knochenspezifischer Gene. Daher ist zu schließen, dass beide miRNAs das Potential besitzen, die Osteogenese - besonders in den frühen Stadien der Keimbahnspezifikation - zu regulieren.
miRNAs als Modulatoren der Osteogenese
Um miRNA Zielkandidaten zu identifizieren, die die beobachteten Effekte auf die Zellviabilität und auf die osteogene Differenzierungen bedingen könnten, wurde ein kombinierter Ansatz aus Bioinformatischer Sequenz- und Prädiktionsanalyse, mRNA Expressionsanalyse und TurboGFP Reduktion nach miRNA Überexpression gewählt. Gepaart mit einer Literatursuche deutete diese Zielkandidatenanalyse darauf hin, dass die identifizierten miRNAs tatsächlich den Aktivierungsstatus des Wnt Signalwegs manipulieren könnten, da viele der prädiktierten Target mRNAs bekannt dafür sind, mit dem Wnt Signalweg zu interagieren.
Um zu bestätigen, dass miR-183, miR-293, miR-361, miR-665 und miR-690 die Osteogenese regulieren, wurde die mRNA/miRNA Interaktion indirekt mittels RT-qPCR studiert. Die Überexpression dieser miRNAs führte zu einer Erniedrigung des mRNA Expressionsspiegels von WIF-1 (Wnt inhibitory factor 1) durch miR-293, NFATc-3 (nuclear factor of activated T cells 3) und Prickle-1 durch miR-361, Dishevelled 1 (Dvl-1) durch miR-665, sowie forkhead box O3 (FoxO-3), Ras homolog gene family, member A (RhoA) und CatnB durch miR-690.
In einem nächsten Schritt konnte durch Nutzung eines speziellen Reportersystems (TurboGFP) eine direkte Interaktion zwischen miR-361 und Prickle-1 nachgewiesen werden. Wie bereits in anderen Studien gezeigt, ist Prickle-1 in der Lage, die Spiegel an Dvl-3 durch Ubiquitinierung des Proteins zu reduzieren, was zur Inhibierung des kanonischen Wnt Signalweges führt. Da Dvls als positive Regulatoren der Osteogenese bekannt sind, indem sie den CatnB Spiegel erhöhen und die lymphoid enhancer factor/T cell factor protein (LEF/TCF) abhängige Transkription stimulieren, könnte Prickle-1 als negativer Regulator fungieren, indem es Dvls von diesem Transkriptionskomplex entfernt.
Abschließend lässt sich zusammenfassen, dass miR-361 in dieser Arbeit als neuartiger Aktivator der osteogenen Differenzierung vorgeschlagen wird. Die molekulare Interaktion zwischen miR-361, Prickle-1 und Dvls bietet einen neuartigen Mechanismus der Wnt Signalaktivierung während der Osteogenese und kann für weitere Untersuchungen zur Identifizierung von Schlüsselkomponenten des Wnt Signalweges herangezogen werden.
| Identifer | oai:union.ndltd.org:DRESDEN/oai:qucosa.de:bsz:15-qucosa-93472 |
| Date | 09 August 2012 |
| Creators | Kaniowska, Dorota |
| Contributors | Universität Leipzig, Medizinische Fakultät, Professor Frank Emmrich, Professor Friedemann Horn |
| Publisher | Universitätsbibliothek Leipzig |
| Source Sets | Hochschulschriftenserver (HSSS) der SLUB Dresden |
| Language | English |
| Detected Language | English |
| Type | doc-type:doctoralThesis |
| Format | application/pdf |
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