Le passage sélectif de molécules à travers la membrane interne des mitochondries est essentiel aux processus métaboliques des cellules eucaryotes. Cette communication cellulaire est assurée par des protéines transmembranaires de la famille des transporteurs mitochondriaux (MCF). Le transporteur ADP/ATP (AAC) est le membre le plus connu et le mieux caractérisé de cette famille. Il est responsable de l'import d'ADP dans la matrice mitochondriale et de l'export d'ATP après synthèse vers le cytosol. La structure d'AAC est connue mais plusieurs questions restent ouvertes concernant le mécanisme du transport, la sélectivité et l'état oligomérique, controversé, de la protéine. Pendant plusieurs années des études biochimiques réalisées sur la protéine solubilisée en détergent étaient en faveur d'une organisation dimérique du transporteur, mais la structure d'AAC, monomérique a remis en cause ce dogme. Afin de caractériser l'organisation oligomérique d'AAC in vivo, nous avons combiné plusieurs approches. Nous avons réalisé des expériences de FRET (Fluorescence Resonance Energy Transfer) directement sur des cellules mammifères ou bactériennes (E. coli) surexprimant la protéine AAC fusionnée avec des sondes FRET. En parallèle, nous avons mis au point des tests fonctionnels afin de contrôler l'état des mitochondries et l'activité du transporteur dans ces cellules. Enfin nous avons étudié la stoechiométrie de liaison de l'inhibiteur carboxyatractyloside grâce à des mesures de respiration sur des mitochondries extraites de foie de rat et placées dans différents états métaboliques. L'ensemble des résultats présentés dans ce manuscrit ont permis de montrer que 1) l'unité fonctionnelle d'AAC est monomérique 2) l'organisation structurale d'AAC dans les membranes natives dépend de l'état métabolique des mitochondries et peut être associée à des phénomènes de régulation. / The transport of small molecules through the inner mitochondrial membrane is essential in eukaryotic metabolism and is selectively controlled by a family of integral membrane proteins, the Mitochondrial Carrier Family (MCF). The ADP/ATP carrier (AAC), which is responsible for the import of ADP to the matrix of mitochondria and the export of newly synthesized ATP toward the cytosol, is the best-known and characterized MCF member. Although its structure sheds light on several aspects of the carrier activity, additional investigations are still required to decipher the whole transport mechanism, to understand the specificity and to characterize the controversial oligomeric state of the protein. For many years, based on studies mainly carried on detergent solubilized AAC the general consensus has been in favor of a dimeric organization of the carrier. The AAC three-dimensional structure, monomeric, broke this dogma. In order to get a precise insight into the in vivo oligomeric organization of AAC we combined several approaches. Fluorescence resonance energy transfer (FRET) measurements were performed directly on mammalian and E.coli cells expressing AAC labeled with several types of FRET probes. In parallel, different functional assays were established to control the state of the mitochondria in these cells and the transport activity of these AAC fusions. Lastly, measurements of the respiration rate coupled to the titration of the inhibitory effect of carboxyatractyloside on isolated rat liver mitochondria were used to investigate the organization of AAC in native mitochondria within two regimes of oxidative phosphorylation. Taken together the results described herein revealed that 1) AAC can function mechanistically as a monomer, 2) the organization of AAC in native membranes might be related to the state of the mitochondria and be involved in regulation.
Identifer | oai:union.ndltd.org:theses.fr/2012GRENY018 |
Date | 12 June 2012 |
Creators | Moiseeva, Vera |
Contributors | Grenoble, Pebay-Peyroula, Eva |
Source Sets | Dépôt national des thèses électroniques françaises |
Language | French |
Detected Language | English |
Type | Electronic Thesis or Dissertation, Text |
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