Mps1 est une protéine kinase à double spécificité impliquée dans le point de contrôle du fuseau mitotique et l'alignement des chromosomes. L'augmentation de l'activité de Mps1 est corrélée avec une augmentation de son niveau de phosphorylation lors de l'entrée en mitose. Cependant, les mécanismes contrôlant cette activation sont inconnus. Nous avons donc cherché à identifier les sites de phosphorylation de Mps1 afin d'étudier leur contribution à la régulation de Mps1. Par spectrométrie de masse, nous avons identifié jusqu'à 27 sites, et nous avons choisi de mutagéniser 11 d'entre eux individuellement en acides aminés non-phosphorylables (alanine), sur la base de leur conservation entre la protéine humaine et de xenope. Nous montrons que trois de ces sites de phosphorylation (S283, T697 et T707) sont essentiels pour l'activité kinase de Mps1, et pour son rôle dans le checkpoint mitotique. Deux de ces sites (T697 et T707) sont localisés dans la boucle d'activation du domaine kinase de Mps1 et sont des sites d'autophosphorylation. La phosphorylation sur le troisième site (S283) requiert une autre kinase. S283 est localisée dans le domaine non-catalytique de Mps1 qui est peu caractérisé et est impliqué dans le recrutement de Mps1 au kinétochore. Nous montrons par immunofluorescence que l'absence de phosphate sur le site S283 ne perturbe pas significativement le recrutement de Mad2 au kinétochore. Enfin, en utilisant des inhibiteurs et l'anticorps spécifique de la phosphorylation du site S283 que nous avons développé, nous montrons que le site S283 est phosphorylé en mitose par CDK, suggérant que les fonctions de Mps1 qui sont spécifiques de la mitose soient régulées par une phosphorylation dépendante des CDKs. / Mps1 is a dual-specificity protein kinase involved in the spindle assembly checkpoint and chromosome alignment. Mps1 phosphorylation state and activity increase in mitosis. However, the regulatory mechanisms underlying these observations are unknown. We therefore sought to identify Mps1 phosphorylation sites and to study their contribution to Mps1 regulation. By mass spectrometry we identified up to 27 phosphorylation sites on Mps1. We chose 11 sites that were conserved between Xenopus and human Mps1, and constructed 11 non-phosphorylatable single point mutants. We show that three phosphorylation sites (S283, T697 and T707) are essential for the kinase activity and the checkpoint signalling function of Mps1. Two of these sites (T697 and T707) are located in the activation loop of Mps1 kinase domain and are autophosphorylation sites. Phosphorylation on the third site (S283) results from the activity of an upstream kinase. S283 is located in the less characterized non-catalytic domain that is responsible for the kinetochore localization of Mps1. By immunofuorescence we show that the absence of the phosphate at S283 does not significantly perturb the kinetochore recruitment of the spindle assembly checkpoint component Mad2. Finally, using inhibitors and our developed phosphospecific antibody we demonstrate that Mps1 is phosphorylated at S283 in mitosis by cyclin-dependent kinase (Cdk), suggesting that mitosis specific functions of Mps1 kinase are regulated by Cdk-dependent phosphorylation.
| Identifer | oai:union.ndltd.org:theses.fr/2010MON20099 |
| Date | 09 July 2010 |
| Creators | Stonyte Morin, Violeta |
| Contributors | Montpellier 2, Abrieu, Ariane |
| Source Sets | Dépôt national des thèses électroniques françaises |
| Language | English, French |
| Detected Language | French |
| Type | Electronic Thesis or Dissertation, Text |
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