En plus d’être l’intermédiaire entre l’ADN et les protéines, l’ARN est impliqué dans plusieurs processus biologiques : régulation et expression des gènes (riboswitches, ARNm et ARNt) ou encore catalyse (ribozymes). La fonction de chaque ARN est liée à sa structure et à sa dynamique de repliement. Des cations tel que le magnésium se lient à l’ARN et peuvent être essentiels au bon repliement et à la stabilité de ces structures. L’obtention de détails structuraux et thermodynamiques sur l’interaction avec le magnésium a donc une grande importance dans la compréhension de la relation structure-fonction. La première partie de ce travail a consisté en la caractérisation des équilibres de liaison entre le magnésium et des motifs d’ARN modèles, appelés « kissing complexes », par spectrométrie de masse native (SM). Grâce à la SM, il est possible de distinguer les stoechiométries de liaison du magnésium. Le travail présenté ici a permis l’élaboration d’une méthode pour quantifier chaque espèce en prenant en compte la distribution d’adduits non-spécifiques. Afin d’aller plus loin dans la localisation du magnésium, nous avons utilisé la spectrométrie de masse en tandem (SM/SM). Nous avons également étudié le comportement des complexes d’ARN en phase gazeuse en utilisant la spectrométrie de mobilité ionique (SMI), avec pour but de détecter des changements de conformation dus à la liaison de cations ou ligands. Contrairement à ce qui était anticipé, nous avons démontré que les duplexes d’ADN et ARN ainsi que les « kissing complexes » subissaient une compaction significative en phase gazeuse aux états de charge initialement obtenus par SM native, ce qui pourrait cacher l’effet des cations. Notre travail a montré comment la spectrométrie de masse peut apporter de nouvelles indications sur les stoechiométries et affinités entre ARN et cations, et discute de certaines limitations quant à l’utilisation de techniques en phase gazeuse pour explorer les structures en solution. / Besides being the molecular intermediate between DNA and proteins, RNA can have many other functions such as gene regulation (riboswitches), gene expression (mRNA and tRNA) or catalysis (ribozymes). RNA function is linked to its structure and its folding dynamics. Cations such as magnesium bind to RNA and are in some instances essential for proper folding and for stability. The need of structural and thermodynamic details about Mg2+ interactions is then of upmost importance in the study of the structurefunction relationships. The first part of our work consists in characterizing the binding equilibria between magnesium and RNA model motifs, called kissing complexes, using native mass spectrometry (MS). MS makes it possible to distinguish individual binding stoichiometries, and the present work consisted in developing a method to quantify each species, taking into account the contribution of nonspecific adducts. We also explored how tandem mass spectrometry (MS/MS) could further help localizing magnesium ions. Further, we explored the structures of RNA complexes in the gas phase using ion mobility mass spectrometry (IMMS), with the aim to detect shape changes upon cation or ligand binding. But in contrast with anticipations, we found that DNA and RNA duplexes as well as RNA kissing complexes undergo a significant compaction at charge states naturally produced by native ESI-MS, which may hide the effect of cations. Our work showcases how mass spectrometry can bring novel information on RNA-cation binding stoichiometries and affinities, but also discusses some limitations of a gas-phase method to probe solution structures.
| Identifer | oai:union.ndltd.org:theses.fr/2017BORD0892 |
| Date | 19 December 2017 |
| Creators | Rabin, Clemence |
| Contributors | Bordeaux, Gabelica, Valérie |
| Source Sets | Dépôt national des thèses électroniques françaises |
| Language | English |
| Detected Language | French |
| Type | Electronic Thesis or Dissertation, Text |
Page generated in 0.0021 seconds