Tumormodelle, in denen die maligne Transformation durch definierte Onkogene experimentell ausgelöst und unterhalten wird, bieten vielfältige Möglichkeiten, die komplexen Mechanismen der Tumorentstehung und Therapieresistenz zu untersuchen und neue Ansätze für Diagnostik und Therapie auszuarbeiten. KRAS-Onkogen-„getriebene“ Transformationsmodelle spiegeln neben anderen tumorspezifischen Veränderungen insbesondere die charakteristischen Änderungen des Transkriptoms wider. In der vorliegenden Arbeit wird ein Modell für Ovarialtumore auf Grundlage von Rose Zellen („Rat ovarian surface epithelium“) verwendet, um die Rolle von Transkriptionsfaktoren, welche durch die KRAS-vermittelte Signaltransduktion hoch reguliert werden, zu untersuchen. Die KRAS-transfomierten Derivate der normalen Rose Zellen zeigen die typischen Merkmale von ankerunabhängigen und invasiven Tumorzellen. Aufgrund der hohen Komplexität sind die Interaktionen zwischen der zytoplasmatischen Signaltransduktion und dem durch sie regulierten Transkriptionsfaktornetzwerk noch weitgehend unverstanden. Die Transkriptionsfaktoren Fosl1, Hmga2, Klf6, JunB, Otx1, Gfi1 und RelA wurden systematisch mittels RNA-Interferenz in KRAS-transformierten Rose Zellen transient ausgeschaltet. Danach wurden Proliferation, Morphologie (epithelial-mesenchymale Transition, EMT) und Ankerunabhängigkeit der Zellen bestimmt. Alle untersuchten Transkriptionsfaktoren beeinflussten die KRAS-induzierten morphologischen Veränderungen teilweise, belegt durch die Abnahme der EMT-Merkmale nach siRNA-vermittelter Ausschaltung. Der Knock-down der Transkriptionsfaktoren Otx1, Gfi1 und RelA hemmte die Proliferation, während Fosl1, Hmga2, Klf6 und JunB die generelle Proliferationsfähigkeit nicht beeinflussten, jedoch spezifisch die ankerunabhängige Proliferation blockierten. Diesen Faktoren kommt daher eine spezifische Funktion in der neoplastischen Transformation zu, da die Ankerunabhängigkeit sehr gut mit der Tumorigenität korreliert ist. Um die Beteiligung der Transkriptionsfaktoren an der Deregulation von Zielgenen zu erfassen, wurden Genexpressionsmuster aller Zellen, in denen jeweils ein Faktor durch siRNA ausgeschaltet war, mittels Microarray-Analyse identifiziert. Auf dieser Grundlage wurde ein Netzwerk-Modell der regulatorischen Interaktionen zwischen den Transkriptionsfaktoren berechnet. Die Existenz der beiden funktionellen Gruppen wurde im Modell bestätigt. Darüber hinaus zeigte sich eine gegenseitige Abhängigkeit des transkriptionellen Netzwerks und der zytoplasmatischen Signaltransduktion, gemessen mittels Proteinanalyse der mitogenabhängigen Signalkinasen (MAPK). Diese wird als kompensatorische Regulation interpretiert, welche trotz Pertubation, experimentell durch siRNA, das effiziente Überleben der transformierten Zellen sicherstellt. Die vorliegende Studie schafft somit die Voraussetzung und Motivation, das reduzierte Netzwerk aus sieben Komponenten auf alle differentiell exprimierten Transkriptionsfaktoren zu erweitern. Möglicherweise behindern solche Regulationskreise in der klinischen Situation die effektive Wirkung zielgerichteter Therapien. / Tumor models, in which malignant transformation was experimentally triggered and maintained through defined oncogenes, offer manifold opportunities to determine the complex mechanisms of tumor progression and resistance to therapies, and to develop new strategies for diagnosis and therapy. Particularly, KRAS oncogene driven models of transformation reflect the characteristic alterations of the transcriptome, among other tumor specific changes. In the present work a model for ovarian cancer based on Rose („Rat ovarian surface epithelium“) cells has been used to evaluate the role of transcription factors, which are up-regulated through KRAS dependent signaling. The KRAS transformed derivates of normal ROSE cells exhibit typical characteristics of anchorage-independent and invasive tumor cells. Due to the high complexity of cellular networks, the interactions between cytoplasmic signalling and their regulated transcription factors are not well understood. The transcription factors Fosl1, Hmga2, Klf6, JunB, Otx1, Gfi1 and RelA were systematically eliminated by transient RNA interference in KRAS transformed ROSE cells. The proliferation, morphology (epithelial-mesenchymal transition, EMT) and anchorage-independence of the cells were determined. All of the selected transcription factors had partial effect on the KRAS induced morphologic changes, documented by reduction of EMT-properties after siRNA treatment. The knock-down of the transcription factors Otx1, Gfi1 and RelA blocked proliferation in general, whereas Fosl1, Hmga2, Klf6 and JunB had no influence on proliferation but specifically blocked the anchorage-independence. Thus, these factors exhibited essential functions in the process of neoplastic transformation, because the anchorage-independence correlates very well with tumorigenicity. In order to elucidate the involvement of the transcription factors in the genetic deregulation of their target genes, microarray based gene expression profiles were determined from all cells in which one factor was eliminated by siRNA. Based on these data, a network model of regulatory interactions among these transcription factors was calculated. The existence of both functional groups was confirmed by the model. Furthermore, an interdependence of the transcriptional networks and cytoplasmatic signaling was observed by protein analysis of the mitogen dependent signal kinases (MAPK). This was interpreted as compensatory regulation, which in spite of experimental perturbation by siRNA, permitted efficient survival of the transformed cells. Thus, the present work provides the basis and motivation to extend the reduced network composed of seven components to all regulated transcription factors. Potentially, such regulatory networks diminish the efficacy of targeted therapies in clinical situations.
| Identifer | oai:union.ndltd.org:HUMBOLT/oai:edoc.hu-berlin.de:18452/16769 |
| Date | 24 March 2010 |
| Creators | Stelniec, Iwona |
| Contributors | Lucius, Richard, Schäfer, Reinhold, Herzel, Hanspeter |
| Publisher | Humboldt-Universität zu Berlin, Mathematisch-Naturwissenschaftliche Fakultät I |
| Source Sets | Humboldt University of Berlin |
| Language | German |
| Detected Language | English |
| Type | doctoralThesis, doc-type:doctoralThesis |
| Format | application/pdf, application/octet-stream, application/octet-stream |
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