Nephrin, a key component of the filtration slit diaphragm, undergoes post-translational modifications in the endoplasmic reticulum (ER). Mutations in nephrin lead to proteinuria. We examined the effects of missense mutations in nephrin on protein folding in the ER, cellular trafficking, and induction of the unfolded protein response (UPR). Wild type (WT) nephrin and the I171N, G270C, S366R, S724C and R743C mutant cDNAs were expressed in 293T cells or glomerular epithelial cells (GECs) by transient transfection. Association of nephrin with the ER chaperone, calnexin, was studied by co-immunoprecipitation. Activation of the UPR was assessed by monitoring expression of the ER chaperone, Grp94, phosphorylation of eukaryotic translation initiation factor-2α subunit (eIF2α), and induction of C/EBP homologous protein-10 (CHOP), as well as activating transcription factor-6 (ATF6)-luciferase reporter activity. All nephrin mutants showed increased association with calnexin, compared with WT nephrin. The I171N and G270C mutants increased expression of Grp94 in 293T cells, and stimulated ATF6-luciferase activity in both 293T cells and GECs. Nephrin S366R and S724C tended to induce the UPR, but changes in Grp94 and ATF6-luciferase activity were less consistent. The R743C mutant did not enhance Grp94 expression, nor ATF6-luciferase activity. All nephrin mutants did not increase eIF2α phosphorylation, nor CHOP expression. Immunofluorescence microscopy showed WT nephrin at the plasma membrane, while the I171N and S366R mutants were perinuclear, colocalized with calnexin. Moreover, the two nephrin mutants induced aggregation of the ER chaperone, calreticulin, compared with WT. Treatment of cells with castanospermine (which reduces the interaction of nephrin with calnexin) resulted in a portion of nephrin I171N and S366R appearing at the plasma membrane. Thus, certain nephrin mutants show impaired folding in the ER, and activate the ATF6 branch of the UPR. Induction of ER chaperones may represent a cytoprotective response, allowing cells to withstand proteotoxic injury. Blocking the interaction of nephrin with calnexin results in a partial rescue of certain nephrin mutants to the plasma membrane. / La néphrine, un composant clé du diaphragme de fente, subit des modifications post-traductionnelles dans le réticulum endoplasmique (RE). Des mutations de la néphrine provoquent une protéinurie. Nous avons examiné les effets des mutations faux-sens de la néphrine sur le repliement de cette protéine dans RE, sur son trafic cellulaire et sur l'induction de réponse déplié protéines (UPR). Le type sauvage (TS) de la néphrine et les mutants d'ADNc, I171N, G270C, S366R, S724C et R743C ont été exprimés dans des cellules 293T ou cellules glomérulaires épithéliales (GECs) par une transfection transitoire. Association de néphrine avec le chaperon de RE, la calnexine, a été étudiée par la co-immunoprécipitation. Activation de l'UPR a été évaluée par l'étude de l'expression du chaperon du RE, Grp94, la phosphorylation de la sous-unité (eIF2α) du facteur 2α d'initiation de la traduction eucaryote, et l'induction de C/EBP homologue de la protéine-10 (CHOP), ainsi que l'activation du facteur-6 de la transcription (ATF6)- l'activité luciférase du gène rapporteur. Tous les mutants de la néphrine ont montré l'association accrue avec la calnexine, par rapport au TS de la néphrine. Les mutants I171N et le G270C ont augmenté l'expression du Grp94 dans les cellules 293T, ont stimulé l'ATF6-activité luciférase dans les deux cellules 293T et GECs. Néphrine S366R et S724C ont tendance à induire l'UPR, mais les changements dans le Grp94 et l'activité ATF6-luciférase ont été moins cohérents. Le mutant R743C n'a pas amélioré l'expression de Grp94, ni l'ATF6-activité luciférase. Tous les mutants de la néphrine n'ont pas augmenté ni la phosphorylation d'eIF2α, ni l'expression de CHOP. La microscopie en immunofluorescence a montré la localisation du TS néphrine à la membrane plasmique, tandis que les mutants I171N et S366R à la partie périnucléaire, colocalisés avec la calnexine. Par ailleurs, les deux mutants de néphrine ont provoqué l'agrégation du chaperon du RE, la calréticuline, par rapport au TS. Le traitement des cellules avec la castanospermine (qui réduit l'interaction de la néphrine avec la calnexine) a entraîné la localisation d'une partie des mutants I171N et S366R de la néphrine à la membrane plasmique. Ainsi, certains mutants de néphrine montrent une déficience du repliment de la protéine dans RE et activent la branche ATF6 de l'UPR. L'induction de chaperons du RE peut représenter une réponse cytoprotectrice, permettant aux cellules de résister aux lesions protéotoxique. Le blocage de l'interaction de la néphrine avec la calnexine resulte à un retour partiel au TS de certains mutants de néphrine, et donc à la localisation de néphrine à la membrane plasmique.
| Identifer | oai:union.ndltd.org:LACETR/oai:collectionscanada.gc.ca:QMM.106541 |
| Date | January 2012 |
| Creators | Drozdova, Tetyana |
| Contributors | Andrey V E Cybulsky (Internal/Supervisor) |
| Publisher | McGill University |
| Source Sets | Library and Archives Canada ETDs Repository / Centre d'archives des thèses électroniques de Bibliothèque et Archives Canada |
| Language | English |
| Detected Language | French |
| Type | Electronic Thesis or Dissertation |
| Format | application/pdf |
| Coverage | Master of Science (Department of Medicine) |
| Rights | All items in eScholarship@McGill are protected by copyright with all rights reserved unless otherwise indicated. |
| Relation | Electronically-submitted theses. |
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