The Adenovirus type 5 E4orf4 protein (E4orf4) is a multifunctional protein that regulates viral transcription and splicing. Much of the activity of E4orf4 is thought to be mediated through binding of the Protein Phosphatase 2A (PP2A). E4orf4 recruits target phosphoproteins into complexes with PP2A resulting in dephosphorylation of host factors, such as SR splicing factors and the AP-1 transcription factor. However, the full complement of cellular factors that interact with E4orf4, and the molecular mechanisms that E4orf4 utilizes during replication to regulate gene expression remain poorly understood. In the following study, we utilized immunoprecipitation followed by mass spectrometry to identify novel interacting proteins with E4orf4. Interestingly, we identified a nucleoporin, Nup 205, a component of the nuclear pore complex as an interacting partner. We show that the Arginine Rich Motif (ARM) of E4orf4 is required for interaction with Nup 205 and for nuclear localization of E4orf4. ARMs are commonly found on many viral nuclear proteins. Interestingly, we observed that Nup 205 interacts with three different viral nuclear proteins containing ARMs. In each case, viral ARM proteins also bound to the same region on Nup 205. Point mutations of the ARM sequence on each of the three viral proteins resulted in loss of interaction with Nup 205 and loss of nuclear localization of the viral protein. Nup 205 may therefore represent a common cellular target for viruses encoding ARM containing proteins. We have further tested the role of E4orf4 and Nup 205 in adenovirus replication and gene expression. Previous studies have shown that compared to wild type adenovirus, E4orf4 deficient adenovirus (Orf4-) have elevated E1A and E4orf6 expressions and reduced late protein production. Such effects are phenotypically copied by the loss of Nup 205, where wild type adenovirus infecting H1299 cells with reduced level of Nup 205 also results in elevated E1A and E4orf6 and reduced late protein production. Furthermore, knockdown of Nup 205 resulted in reduced cytopathic effect and a more than four-fold reduction in the replication of wild type adenovirus. Taken together, these data suggest Nup 205 is required by adenovirus for proper regulation of gene expressions and viral replication, and that interaction with E4orf4 may mediate these effects. Since E4orf4 is known to deregulate phosphorylation of its target proteins, our future studies will focus on identifying phosphorylation sites on Nup 205 and determining the effect of E4orf4 on such sites and nucleopore structure and function. / La protéine multifonctionnelle E4orf4 de l'adénovirus de type 5 régule la transcription et l'épissage viral. L'activité de E4orf4 est assurée par son interaction avec la protéine phosphatase 2A (PP2A). Le complexe E4orf4/PP2A déphosphoryle certaines phosphoprotéines, comme le facteur d'épissage SR (riche en arginines et en sérines) et le facteur de transcription AP1. Cependant, les mécanismes de régulation d'expression génique pendant la réplication virale qui sont contrôlés par E4orf4 et ses partenaires restent inconnus. Au cours de cette étude, l'utilisation de la technique d'immunoprécipitation et de spectrométrie de masse nous a permis d'identifier des nouvelles protéines qui interagissent avec E4orf4, en particulier le composé du pore nucléaire Nup 205. Nous avons démontré que le motif riche en arginine (ARM – arginine rich motif), présent dans la protéine E4orf4 et autres protéines nucléaire virales, est nécessaire pour son interaction avec Nup 205 et la translocation nucléaire d' E4orf4. De plus, nous avons constaté qu'il y a trois autres protéines nucléaires virales qui interagissent avec la même région de Nup 205 via leur motif ARM. Des mutations ponctuelles du motif ARM sur ces trois protéines virales abolissent leur interaction avec Nup 205 et leur translocation nucléaire. Ceci suggère que Nup 205 est une cible commune pour les virus comportant des protéines ayant un motif ARM. Nous avons étudié ensuite le rôle de E4orf4 et Nup 205 dans l'expression génique et la réplication adénovirale. Précédemment, des travaux avaient démontré que, comparés aux adénovirus de type sauvage, les adénovirus privés de la protéine E4orf4 (Orf4-) expriment à des niveaux élevés les protéines virales E1A et E4orf6, mais présentent une faible production des protéines virales tardives. Nous avons observé que la suppression de Nup 205 donne le même effet que celui observé par la perte de E4orf4. Ainsi, l'infection des cellules H1299, présentant une faible expression de Nup 205, par des adénovirus de type sauvages, nous permet d'observer une augmentation du niveau d'expression de E1A et de E4orf6 et une diminution de la production des protéines virales tardives. De plus, la diminution de l'expression de Nup 205 réduit l'effet cytopathique et diminue de plus de quatre fois la réplication de l'adénovirus de type sauvage.En conclusion, nos résultats démontrent que l'interaction entre Nup 205 et E4orf4 favorise la réplication de l'adénovirus et l'expression des gènes viraux. Comme E4orf4 dérégule la phosphorylation de protéines cibles grâce à son interaction avec PP2A, nos prochaines études porteront sur l'identification des sites de phosphorylation potentiels sur Nup 205, ainsi que sur l'analyse de l'effet de E4orf4 sur chaque site. Nous sommes aussi intéressés par la fonction et la structure du pore nucléaire lorsqu'en complexe avec E4orf4.
| Identifer | oai:union.ndltd.org:LACETR/oai:collectionscanada.gc.ca:QMM.114282 |
| Date | January 2013 |
| Creators | Lü, YiQing |
| Contributors | Jose Guerreiro Teodoro (Internal/Supervisor) |
| Publisher | McGill University |
| Source Sets | Library and Archives Canada ETDs Repository / Centre d'archives des thèses électroniques de Bibliothèque et Archives Canada |
| Language | English |
| Detected Language | French |
| Type | Electronic Thesis or Dissertation |
| Format | application/pdf |
| Coverage | Master of Science (Department of Biochemistry) |
| Rights | All items in eScholarship@McGill are protected by copyright with all rights reserved unless otherwise indicated. |
| Relation | Electronically-submitted theses. |
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