Cancer cells have aberrant DNA methylation patterns which are characterized by hypomethylation of a large set of promoters and hypermethylation of tumor suppressor genes. The dynamic nature of the epigenome makes it a valuable target for therapeutic interventions. This thesis focuses on understanding the use of various inhibitors towards DNA methylation-related proteins and their respective anti-cancer activities at both global and gene-specific levels. The widely used demethylating agent 5-azacytidine and 5-aza-2'-deoxycytidine (5-azaCdR) are FDA-approved drugs for the treatment of myelodysplastic syndrome. However, these nucleoside analogs which trap the DNA methyltransferases (DNMTs) are non-specific. Studies have shown that 5-azaCdR induced pro-metastatic genes and caused long distance metastasis. This raises serious safety concerns for their clinical use. On the contrary, targeting the DNMTs individually or in combination did not result in dramatic induction of pro-metastatic genes as with 5-azaCdR treatment. In particular, single DNMT1-specific inhibition resulted in maximum growth suppression when compared to inhibition of all three major DNMTs, while not increasing cell invasiveness. DNMT1 has been shown to be important for cancer growth. Our study supports the idea that DNMT1 has a major role in cancer over the other DNMTs and that DNMT1 inhibitors could be effective anti-cancer drugs. 5-azaCdR has nevertheless been proven to be a potent suppressor of cancer growth. We tested the idea of a combinatorial treatment that may minimize its side-effects on cell invasion while maintaining its growth suppressor effects. The methyl-CpG binding protein 2 (MBD2) protein has been shown to demethylate pro-metastatic genes. Its inhibition in concurrent with 5-azaCdR treatment synergistically suppressed cancer growth, while reversed the 5-azaCdR-induced invasion. In order to have a deeper understanding of the impact of the treatments, microarrays studies on the methylome and transcriptome of the treated cells were carried out. Bioinformatics analysis indicated that the combined treatment suppressed gene networks that were involved in cell mobility, while synergistically enhanced gene networks that were involved in cell death. This data indicate that combining 5-azaCdR treatment with MBD2 inhibition results in more potent anti-cancer effects than either treatment alone. In order to explore the currently available drugs that inhibit MBD2, we tested the combination of S-adenosylmethionine (SAM) with 5-azaCdR on the same cancer cell lines. SAM remethylated gene promoters of pro-metastatic genes and repressed 5-azaCdR-induced invasion similarly to MBD2 inhibition. We then investigated the relationship between SAM and MBD2 downregulation and observed hypermethylation on both CpG and non-CpG sites in the MBD2 promoter upon SAM treatment. Interestingly, inhibition of MBD2 using short interference RNA also resulted in hypermethylation of its own promoter. This observation suggested that SAM treatment could directly downregulate MBD2 expression, which is further downregulated through a feedback loop. These results also suggested that SAM treatment could have a direct effect on MBD2 promoter, which in turn affects multiple MBD2 targets that are involved in invasion. Together, the data from this thesis support the idea that targeting the epigenome could be a highly efficacious anti-cancer therapy and that combining drugs that target DNA methylation could increase the potency over individual treatments. / Les cellules cancéreuses présentent un profil de méthylation caractérisé par l'hypométhylation d'un grand nombre de promoteurs et l'hyperméthylation de gènes suppresseurs de tumeur. La nature dynamique de l'épigénome en fait une cible de choix pour les interventions thérapeutiques. Cette thèse vise à comprendre l'utilisation de divers inhibiteurs visant des protéines liées à la méthylation de l'ADN et leurs activités anticancéreuses à une échelle génomique globale et au niveau de gènes particuliers. Les agents déméthylants 5-azacytidine et 5-aza-2'-deoxycytidine (5-azaCdR) sont des médicaments pour le traitement du syndrome myélodysplasiqueapprouvés par la FDA. Cependant, ces analogues de nucléosides qui piègent les DNA méthyltransférases (DNMTs) ne sont pas spécifiques. Des études ont montrées que la 5-azaCdR induisait l'expression de gènes pro-métastatiques et l'apparition de métastases. Ceci soulève de sérieuses interrogations quant à leur utilisation en clinique. À l'inverse, le ciblage spécifique des DNMTs ne conduit pas à une induction dramatique des gènes pro-métastatiques. Plus particulièrement, l'inhibition spécifique de DNMT1 résulte en une suppression de la croissance maximale des tumeurs, sans effet sur l'invasion cellulaire, lorsque l'on compare à l'inhibition des trois principales DNMTs. Notre étude supporte l'idée que DNMT1 à un rôle majeur dans le cancer et que le développement d'inhibiteurs de DNMT1 pourraient conduire à des médicaments anti-cancéreux efficaces.Il a néanmoins été montré que la 5-azaCdR était un suppresseur potentiel de la croissance cancéreuse. Nous avons testé l'hypothèse qu'un traitement combiné permettrait de minimiser ses effets secondaires sur l'invasion cellulaire tout en maintenant ses effets suppresseurs de croissance. Il a été montré que la protéine methyl-CpG binding protein 2 (MBD2) participait à la déméthylationde gènes pro-métastatiques. Son inhibition simultanée à un traitement 5-azaCdR abolit de façon synergétique la croissance cancéreuse, tout en inhibant l'invasion induite par la 5-azaCdR. Des analyses du méthylome et du transcriptome ont été réalisées par micropuces à partir de cellules traitées avec un siRNA dirigé contre l'ARNm de MBD2 et la 5-azaCdR afin d'avoir une meilleure compréhension de l'impact de la combinaison des traitements. Les analyses bioinformatiques ont indiqué que le traitement combiné réprimait des réseaux de gènes impliqués dans la mobilité cellulaire tandis que les réseaux de gènes activés étaient impliqués dans la mort cellulaire. Ces données indiquent que le traitement à la 5-azaCdR combiné avec l'inhibition de MBD2 résulte en de plus puissants effets anti-cancéreux que l'un ou l'autre des traitements individuels.Nous avons également testé la combinaison de la S-adenosylmethionine (SAM), un médicament actuellement disponible sur le marché et inhibant l'activité de MBD2, avec la 5-azaCdR sur les lignées cellulaires utilisées précédemment. La SAM, de façon similaire à l'inhibition de MBD2 par un siRNA, permet la méthylation des promoteurs de gènes pro-métastatiques et réprime l'invasion induite par la 5-azaCdR. Nous avons ensuite examiné la relation entre la SAM, la diminution de l'expression de MBD2 et l'hyperméthylation observée à la fois aux sites CpG et non-CpG au niveau du promoteur de MBD2 après traitement avec la SAM. De façon intéressante, l'inhibition de MBD2 par des petits ARN interférant résulte également en une hyperméthylation de son propre promoteur. Cette observation suggère que le traitement avec SAM pourrait directement réduire l'expression de MBD2, qui serait réduite encore plus via une boucle de rétrocontrôle. L'ensemble des données de cette thèse supporte l'idée que le ciblage de l'épigénome pourrait être une thérapie anti-cancéreuse hautement efficace et que la combinaison de médicaments qui ciblent la méthylation de l'ADN pourrait augmenter l'efficacité des traitements individuels.
| Identifer | oai:union.ndltd.org:LACETR/oai:collectionscanada.gc.ca:QMM.114316 |
| Date | January 2013 |
| Creators | Chik, Pui Chi Flora |
| Contributors | Moshe Szyf (Supervisor) |
| Publisher | McGill University |
| Source Sets | Library and Archives Canada ETDs Repository / Centre d'archives des thèses électroniques de Bibliothèque et Archives Canada |
| Language | English |
| Detected Language | French |
| Type | Electronic Thesis or Dissertation |
| Format | application/pdf |
| Coverage | Doctor of Philosophy (Department of Pharmacology & Therapeutics) |
| Rights | All items in eScholarship@McGill are protected by copyright with all rights reserved unless otherwise indicated. |
| Relation | Electronically-submitted theses. |
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