The Rab5 and Rab7 GTPases are key regulators of endosome to lysosome trafficking, whose activities are positively regulated by Rab Guanine nucleotide Exchange Factors and negatively regulated by GTPase Activating Proteins (GAP). In this thesis, the nematode Caenorhabditis elegans was used as a model system to study regulation of Rab GTPase-mediated endosomal trafficking, for simple genetics and easy visualization of organelles under Differential Interference Contrast (DIC) and confocal optics. It was previously demonstrated that TBC-2 functions as a RAB-5 GAP. Loss of tbc-2 activity results in the formation of enlarged late endosomes in the intestine that require the activities of RAB-5, RAB-7 and components of the homotypic fusion and vacuole protein sorting (HOPS) complex. TBC-2 colocalizes with RAB-7 on late endosomes, and requires RAB-7 for membrane localization. My hypothesis is that RAB-7 recruits TBC-2 to late endosomes to inactivate RAB-5 and possibly RAB-7 itself, to facilitate early to late endosome maturation. The vh8 mutant was previously identified in the lab as a suppressor of the tbc-2(-) phenotype and displaces GFP::RAB-7 from vesicular membranes. It is possible that vh8 encodes for a potential RAB-7 GEF. To investigate the molecular identity of vh8, I tested candidate genes by RNAi. While none of the candidates appear to be vh8, I did find that the HOPS core complex is required for the tbc-2(-) phenotype. ARL-8, and its human homolog arl8b, have recently been shown to be important for late endosome to lysosome trafficking. To investigate whether ARL-8 is required for TBC-2 mediated early to late endosome trafficking, I performed RNAi experiments. The results of which suggest that ARL-8 functions downstream of TBC-2. ARL-8 is required for the tbc-2(-) large late endosome phenotype, but is not required for membrane localization of either TBC-2 or RAB-7.In mammalian cells, the Rac1 GTPase is able to bind Armus, a human homolog of TBC-2. That raises the possibility that RAB-7 recruits CED-10/Rac1 via TBC-2. However, I observe that in tbc-2(tm2241) mutant animals, CED-10 is still localized to vesicles. It suggests that CED-10 might be recruited to membrane via other mechanism. Active CED-10 is also crucial for phagocytosis and clearance of apoptotic cell corpses. CED-10 can be activated by the CED-5/CED-12 complex, which is proposed to be recruited and activated by PI(3,5)P2. Work from this thesis suggests that the active state might not be a requirement for CED-10 localization, as ced-5 RNAi does not change the localization of CED-10. / Les GTPases Rab5 et Rab7 participent à la régulation du traffic des endosomes. L'activité de ces protéines est régulée positivement par les "Rab Guanine nucleotide Exchange Factors" (GEF) et régulée négativement par les "GTPase Activating Proteins" (GAP). Dans ce projet, le nematode Caenorhabditis elegans a été utilisé comme modèle pour étudier la régulation du traffic endosomal médié par les Rab GTPase car celui-ci est un bon modèle génétique et permet une visualisation des organites à l'aide de microscopie à constraste d'interférence différentielle et de microscopie confocale. Il a été démontré dans la passé que TBC-2 fonctionne en tant que GAP pour RAB-5. La perte de l'activité de tbc-2 résulte en la formation d'endosomes tardifs élargis dans les intestins des nématodes, qui requièrent normalement l'activité de RAB-5, RAB-7 et des constituants du complexe "homotypic fusion and vacuole protein sorting" (HOPS). TBC-2 se retrouve avec RAB-7 sur les endosomes tardifs et nécessite RAB-7 pour sa localisation sur la membrane. Notre hypothèse était que RAB-7 recrute TBC-2 aux endosomes tardifs pour inactiver RAB-5 et possiblement RAB-7, ce qui facilite la maturation des endosomes en endosomes tardifs. Le mutant vh8 a préalablement été identifié dans le laboratoire en tant que suppresseur du phénotype tbc2(-) et cause le déplacement de GFP::RAB-7 des membranes vésiculaires. Il est possible que vh8 exprime un potentiel GEF de RAB-7. Pour trouver l'identité moléculaire de vh8, nous avons testé les gènes candidats à l'aide d'ARN d'interférence (ARNi). Malgré qu'aucun des candidats ne semblaient être vh8, nous avons découvert que le complexe central de HOPS est nécessaire au phénotype tbc-2(-). ARL-8 et son homolog humain arl8b ont récessement été démontrés comme étant importants dans le traffic des endosomess tardifis aux lysosomes. Pour vérifier si ARL-8 est requis dans le traffic des endosomes médiés par TBC-2. Nos travaux à l'aide d'ARNi suggèrent qu'ARL-8 fonctionne en aval de TBC-2. ARL-8 est nécessaire à l'apparition du phénotype tbc-2(-), mais n'est pas requis pour la localisation de TBC-2 et RAB-7 à la membrane. Dans les cellules de mammifères, la GTPase Rac1 peut se lier à Armus, un homologue humain de TBC-2. Ceci suggère que RAB-7 pourrait recruter CED-10/RAC1 par l'entremise de TBC-2. Par contre, nous observons que chez les nématodes tbc-2(tm2241), CED-10 est toujours localisé sur les vésicules. Ceci suggère que CED-10 pourrait être recruté à la membrane par d'autres mécanismes. Un CED-10 activé est aussi nécessaire à la phagocytose et à la dégradation des corps cellulaires apoptotiques. CED-10 peut être activé par le complexe CED-5/CED-12, qui est possiblement recruté et activé par PI(3,5)P2. Nos travaux suggèrent par contre que l'activation de CED-10 n'est pas obligatoire à sa localisation, car l'ARNi de ced-5 ne change pas la localisation de CED-10.
| Identifer | oai:union.ndltd.org:LACETR/oai:collectionscanada.gc.ca:QMM.114348 |
| Date | January 2013 |
| Creators | Wang, Xiaolin |
| Contributors | Christian Rocheleau (Internal/Supervisor) |
| Publisher | McGill University |
| Source Sets | Library and Archives Canada ETDs Repository / Centre d'archives des thèses électroniques de Bibliothèque et Archives Canada |
| Language | English |
| Detected Language | French |
| Type | Electronic Thesis or Dissertation |
| Format | application/pdf |
| Coverage | Master of Science (Department of Medicine) |
| Rights | All items in eScholarship@McGill are protected by copyright with all rights reserved unless otherwise indicated. |
| Relation | Electronically-submitted theses. |
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