Extreme deviations from what is considered normal body weight, from anorexia to obesity, have been linked to reduced reproductive function in females. Discovered in 1994, leptin is a signaling hormone released from adipose tissue to mediate satiety effects in the hypothalamus. Leptin secretion is directly proportional to amount of body fat and evidence has accumulated that leptin and its receptor (Lepr) are found in a variety of tissues including granulosa cells (GCs) of the ovary. Thus, leptin through its receptor may play a role in reproductive function in females. Many studies have examined the effects of Lepr in GCs and the ovary, however the results are contradictory and all have been in vitro. Here we present the first in vivo study to examine the role of Lepr in GCs during follicular development and ovulation. Immature superovulated mice were used in all studies and GCs collected by follicle puncture. We first determined the expression profiles of Lepr isoforms (LeprA, LeprB) during follicular and luteal development along with leptin-related signaling molecules and targets. We also analyzed transcription factors potentially regulating Lepr expression in GCs. To examine the response of GCs to leptin in vivo, leptin hormone was administered at various times of follicular and luteal development. Lastly, we blocked Lepr action using a Lepr antagonist (SMLA) and determined its effects on ovulation. LeprA and LeprB were upregulated at 4h post- human chorionic gonadotropin (hCG) with LeprA being the most abundant isoform showing a 23-fold increase from 0 to 4h post-hCG. Leptin was upregulated at the same time and Lepr signaling molecules: signal transducer and activator of transcription 3 (Stat3), and suppressor of cytokine signaling 3 (Socs3), were upregulated just after Lepr induction at 7 and 12h post-hCG, respectively. CCAAT/enhancer-binding protein beta (Cebpb), which was induced at 1h post-hCG, was shown to associate with the Lepr promoter and thus regulate Lepr expression. Early growth response protein 1 (Egr1) protein and mRNA data revealed it to be another potential regulatory transcription factor with upregulation at 1h post-hCG, just prior to Lepr upregulation. Thus, the mRNA profiles of genes examined provide evidence of a role for Lepr during the periovulatory period. This was further confirmed as the in vivo response of GCs to a physiological dose of leptin was enhanced at 6h post-hCG evidenced by phosphorylation of mitogen-activated protein kinase (Mapk) and Stat3 proteins; however showed no change during the early follicular or luteal periods. Leptin treatment also increased expression of ovulation genes: a disintegrin and metalloproteinase with thrombospondin motifs 1 (Adamts1), programmed cell death 1 (Pdcd1), and Egr1. Antagonizing Lepr action reduced ovulation rate by 60% in SMLA-treated animals. This reduction appeared, at least in part, to be due to deregulated gene expression of Adamts10, Adamts19, Hyaluronan synthase 2 (Has2), amphiregulin (Areg), Pentraxin-related protein (Ptx3), and Forkhead box protein O1 (Foxo1). Overall, the results of this study provide molecular mechanisms for Lepr induction and signaling in GCs. In addition, it provides evidence that leptin and Lepr play a positive role during ovulation and are thus essential for optimal female fertility. / Les écarts extrêmes de poids par rapport à ce qui est considéré comme un poids normal, telles que l'anorexie et l'obésité, sont liées à des problèmes de la fonction reproductrice chez la femme. Découverte en 1994, la leptine est une hormone sécrétée par le tissu adipeux dans le but d'informer l'hypothalamus sur l'état de satiété de l'organisme. La libération de leptine est directement proportionnelle à la quantité de tissu adipeux et la présence de l'hormone et de son récepteur (Lepr) a été montrée dans différents tissus incluant les cellules de la granulosa des ovaires. Par conséquent, la leptine, via son récepteur, joue un rôle dans la fonction reproductrice de la femme. De nombreuses études ont étudié les effets de Lepr dans les cellules de la granulosa et dans l'ovaire, mais elles ont toutes été réalisées in vitro et les résultats sont contradictoires. Nous présentons ici la première étude in vivo dans le but d'examiner le rôle de Lepr dans les cellules de la granulosa pendant le développement folliculaire et l'ovulation. Des souris immature produisant un grand nombre d'ovocytes ont été utilisées dans toutes nos expériences et les cellules de la granulosa ont été collectées par ponction folliculaire. Les profils d'expression des isoformes de Lepr (LeprA et LeprB) durant les développements folliculaire et lutéal ont été d'abord déterminés, ainsi que ceux des molécules de la voie de signalisation de la leptine et leurs cibles. Les facteurs de transcription régulant potentiellement l'expression de Lepr dans les cellules de la granulosa ont aussi été analysés. Pour évaluer la réponse des cellules de la granulosa à la leptine in vivo, l'hormone leptine a été administrée à différents moments des développements folliculaire et lutéal. Enfin, le récepteur Lepr a été bloqué grâce à l'utilisation d'un antagoniste de Lepr (SMLA) et les effets de ce blocage sur l'ovulation ont été analysés. L'expression de LeprA et LeprB ont augmenté 4h après administration d'hCG, LeprA étant l'isoforme la plus abondante et présentant une expression 23 fois plus importante de 0 à 4h post-hCG. L'expression de la leptine a augmenté durant le même temps ainsi que celle des molécules de la voie de signalisation de Lepr, Stat3 et Socs3, juste après l'induction de Lepr, respectivement 7h et 12h post-hCG. Cebpb, qui a été induit 1h post-hCG, a été identifié comme étant associé au promoteur de Lepr et donc comme étant un régulateur de l'expression de Lepr. Les données concernant la protéine Egr1 et ses ARNm suggèrent qu'il peut s'agir d'un autre potentiel facteur de transcription régulant l'expression de Lepr, notamment en raison d'une augmentation de son expression 1h post-hCG, juste avant l'augmentation de l'expression de Lepr. Les profils d'ARNm des gènes examinés ont donc fourni la preuve du rôle de Lepr durant la période périovulatoire. Ceci a été ensuite confirmé par l'augmentation de la réponse des cellules de la granulosa in vivo suite à une dose physiologique de leptine 6h post-hCG , mise en évidence par la phosphorylation des protéines Mapk et Stat3. Le traitement avec la leptine a aussi accru l'expression des gènes impliqués dans l'ovulation Adamts1, Pdcd1 et Egr1. Le blocage de l'action de Lepr a réduit le taux d'ovulation de 60% chez les animaux traités avec SMLA. Cette réduction apparaît être due, au moins en partie, à la dérégulation de l'expression des gènes de Adamts10, Adamts19, Has2, Areg, Ptx3, et Foxo1. En conclusion, les résultats de cette étude éclairent les mécanismes moléculaires de l'induction du récepteur Lepr ainsi que de la voie de signalisation qui lui est associée dans les cellules de la granulosa. Pour finir, cette étude fournit des preuves concernant le rôle positif joué par la leptine et Lepr durant l'ovulation, ce qui est essentiel pour optimiser la fertilité de la femme.
| Identifer | oai:union.ndltd.org:LACETR/oai:collectionscanada.gc.ca:QMM.114600 |
| Date | January 2013 |
| Creators | Dupuis, Lisa |
| Contributors | Raj Duggavathi (Internal/Supervisor) |
| Publisher | McGill University |
| Source Sets | Library and Archives Canada ETDs Repository / Centre d'archives des thèses électroniques de Bibliothèque et Archives Canada |
| Language | English |
| Detected Language | French |
| Type | Electronic Thesis or Dissertation |
| Format | application/pdf |
| Coverage | Master of Science (Department of Animal Science) |
| Rights | All items in eScholarship@McGill are protected by copyright with all rights reserved unless otherwise indicated. |
| Relation | Electronically-submitted theses. |
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