The nascent-polypeptide-associated complex and coactivator-alpha (αNAC) is a subunit of a cytosolic heterodimer that binds to ribosomes and newly synthesized polypeptides in a chaperone-like manner. In the nucleus, αNAC acts as a transcriptional coregulator that can potentiate the expression of the osteoblast-specific gene, Osteocalcin (Ocn). One unique feature of αNAC is its sequence-specific DNA binding capacity. By virtue of this unique characteristic, ChIP-chIP technology was used to identify potential target genes of αNAC in mineralizing osteoblasts. One target that emerged from this analysis was Itgβ6. To confirm the result obtained by ChIP-chIP, we performed a formaldehyde cross-linking ChIP in pre-osteoblastic MC3T3-E1 cells. αNAC was shown to bind the Itgβ6 promoter. We next examined the expression profile of Itgβ6 in mineralizing and unmineralized MC3T3-E1 pre-osteoblasts over the course of differentiation. No induction of Itgβ6 expression was observed at any timepoint throughout differentiation. Double cross-linking ChIP in pre-osteoblastic MC3T3-E1 cells showed that αNAC and the corepressor molecule, HDAC1, occupied the Itgβ6 promoter. The ChIP data suggested that HDAC corepressor complexes were recruited by αNAC to the promoter region of Itgβ6 to repress its expression. In differentiating C2C12 myoblasts, a 5-fold induction was observed for Itgβ6 at day 5 suggesting that Itgβ6 is differentially regulated in muscle and bone. We proposed that a possible mechanism of Itgβ6 induction in day 5 myotubes was due to the dissociation of the HDAC1 corepressor complex from the promoter. We performed a double cross-linking ChIP in day 5 myotubes and observed a marked decrease in HDAC1 enrichment suggesting that the release of HDAC1 relieved repression of Itgβ6 and resulted in its induction. To determine if Itgβ6 expression could be induced by suppressing HDAC1 activity we tested the effects of two HDAC inhibitors Trichostatin-A (TSA) and Sodium Butyrate (NaB). In pre-osteoblastic MC3T3-E1 cells, Itgβ6 expression was not induced following treatment with HDAC inhibitors. Similarly, treatment of C2C12 myoblasts with TSA and NaB also showed no induction of Itgβ6 expression. However, a dose-dependent induction of Ocn expression occurred following treatment with TSA and NaB. We concluded that class I HDACs including HDAC1 are important for the repression of Ocn expression in cells of the muscle-cell lineage. Our data demonstrated that αNAC is able to recruit HDACs and form a corepressor complex at the promoter region of the Itgβ6. This suggests a model for αNAC as a multifunctional transcriptional coregulator that could be involved in both gene activation and repression. / La sous-unité alpha du Nascent polypeptide Associated Complex (αNAC) migre au noyau des ostéoblastes différenciés où elle se lie au promoteur du gène Osteocalcin (Ocn) afin de contrôler son expression. Un criblage génomique à l'aide de séquences de promoteurs immunoprécipitées par des anticorps anti-αNAC (ChIP-on-chip) a identifié le gène Integrin β6 (Itβ6) comme un autre gène-cible potentiel de l'activité régulatrice d'αNAC. Nous avons confirmé l'interaction d'αNAC avec le promoteur Itβ6 par méthode conventionnelle d'immunoprécipitation de la chromatine (ChIP). Lorsque nous avons mesuré l'expression d'Itβ6 au cours de la différenciation ostéoblastique, nos résultats montrent que le gène n'est pas exprimé de façon significative. Ces données suggèrent un mode actif de répression de l'expression d'Itβ6. En accord avec ce modèle, nous avons confirmé l'interaction des co-répresseurs Histone De-Acetylase 1 (HDAC1) et HDAC3 au promoteur d'Itβ6, dans un fragment contenant le site de liaison pour αNAC. Cette intéraction est détectée dans les pré-ostéoblastes ainsi qu'au cours de la différenciation, suggérant qu'elle contribue aux mécanismes de répression de l'expression d'Itβ6 dans les ostéoblastes. Par contraste, l'expression d' Itβ6 est induite lorsque des myoblastes se différencient en myotubes, et ce profil d'expression est concommittant à une diminution de l'association de HDAC1 au promoteur Itβ6 dans les myotubes différenciés. Le traitement d'ostéoblastes ou de myoblastes avec des inhibiteurs de l'activité enzymatique HDAC n'influencent pas l'expression de Itβ6, mais induit l'expression d'Ocn dans les myoblastes, démontrant que l'activité enzymatique des HDACs est importante dans la répression des niveaux d'Ocn dans les cellules musculaires mais n'est pas le seul facteur contrôlant la transcription de Itβ6. Nos résultats confirment l'interaction d'αNAC avec le promoteur du gène Itβ6 et indiquent que l'expression du gène est modulée de façon différentielle au cours de la différenciation de cellules mésenchymateuses. Dans l'ensemble, nos données sont en accord avec un modèle dans lequel les protéines HDACs contribuent au fin contrôle de l'expression de Itβ6 au cours de la différenciation des cellules mésenchymateuses.
| Identifer | oai:union.ndltd.org:LACETR/oai:collectionscanada.gc.ca:QMM.114488 |
| Date | January 2013 |
| Creators | Alexander, James |
| Contributors | Rene St-Arnaud (Internal/Supervisor) |
| Publisher | McGill University |
| Source Sets | Library and Archives Canada ETDs Repository / Centre d'archives des thèses électroniques de Bibliothèque et Archives Canada |
| Language | English |
| Detected Language | English |
| Type | Electronic Thesis or Dissertation |
| Format | application/pdf |
| Coverage | Master of Science (Department of Surgery) |
| Rights | All items in eScholarship@McGill are protected by copyright with all rights reserved unless otherwise indicated. |
| Relation | Electronically-submitted theses. |
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