Die Xanthin-Dehydrogenase aus Rhodobacter capsulatus ist ein cytoplasmatisches Enzym, welches ein (αβ)₂ Heterotetramer mit einer Größe von 275 kDa bildet. Die drei Kofaktoren (Moco, 2[2Fe2S], FAD) sind auf zwei unterschiedlichen Polypeptidketten gebunden. So sind die beiden spektroskopisch unterscheidbaren Eisen-Schwefel-Zentren und das FAD in der XdhA-Untereinheit und der Moco in der XdhB-Untereinheit gebunden. Im ersten Teil dieser Arbeit sollte untersucht werden, warum die R. capsulatus XDH ein Dimer bildet und ob ein intramolekularer Elektronentransfer existiert. Dafür wurde eine chimäre XDH-Variante [(α)₂(β₁wt/β₂E730A)] erzeugt, welche eine aktive und eine inaktive XdhB-Untereinheit trägt. Mit Hilfe von Reduktionsspektren sowie mit der Bestimmung der kinetischen Parameter für die Substrate Xanthin und NAD+ konnte gezeigt werden, dass die chimäre XDH-Variante katalytisch halb so aktiv war, wie der auf gleiche Weise gereinigte XDH-Wildtyp. Dies verdeutlicht, dass die noch aktive Untereinheit der Chimären selbstständig und unabhängig Substrat binden und hydroxylieren kann und ein intramolekularer Elektronentransfer zwischen den beiden XdhB-Untereinheiten nicht stattfindet.
Ein weiteres Ziel war die funktionelle Charakterisierung der Mus musculus AOX1 sowie der humanen AOX1 hinsichtlich ihrer Substratspezifitäten und ihrer biophysikalischen Eigenschaften sowie der Charakterisierung der konservierten Aminosäuren im aktiven Zentrum der mAOX1. Da bislang noch kein heterologes Expressionssystem für ein aktives und stabiles rekombinantes AO-Protein existierte, wurde ein E. coli Expressionssystem mit der gleichzeitigen Expression der entsprechenden Mocosulfurase für mAOX1 und hAOX1 in dieser Arbeit etabliert. Mit Hilfe dieser Koexpression konnte die Aktivität der rekombinanten mAOX1 um 50 % gesteigert werden, wenn gleich auch der sulfurierte Moco-Anteil nur 20 % betrug.
Um die konservierten Aminosäuren im aktiven Zentrum hinsichtlich ihrer Funktion der Substratbindung zu charakterisieren, wurden folgende Varianten erzeugt: V806E, M884R, V806/M884R sowie E1265Q. Mit Hilfe von kinetischen Substratuntersuchungen konnte gezeigt werden, dass die beiden Aminosäuren Val806 und Met884 für die Erkennung und die Stabilisierung von Aldehyden und N-Heterozyklen essentiell sind. Ein Austausch dieser beiden gegen Glutamat bzw. Arginin (wie bei R. capsulatus XDH) zeigte jedoch keine Xanthin- oder Hypoxanthinumsetzung. Für das Glu1265 wurde ebenfalls die Rolle als die Katalyse initiierende Aminosäure belegt. / The main task of this work was to analyse the function of R. capsualtus Xanthine Dehydrogenase (R.c. XDH; EC 1.17.1.4) as well as to characterize the structure and function of mouse Aldehyde Oxidase (mAOX1; EC 1.2.3.1). Both enzymes are complex metallo-flavoproteins that contain two nonidentical [2Fe2S] clusters, FAD and the molybdenum cofactor (Moco) as catalytically acting units. AO and XDH are members of the xanthine oxidase family characterized by an equatorial sulfur ligand at the Moco site essential for enzyme activity.
To solve the question why R.capsualtus XDH forms a dimer a chimeric variant of bacterial XDH was produced and expressed in E.coli.
By means of the (alphabeta)(2) XDH heterotetramer variant, that should include only one active Moco-center, it should be analysed if the two subunits act independent without cooperativity.
AO is characterized by broad substrate specificity and this makes it an important enzyme for the metabolism of drugs and xenobiotica. The biochemical and physiological function of AO is still largely obscure and only limited information is available on the physiological substrates of AO or the role of the enzyme in mammalia. The substrate specificity of the recombinant AO should be determined by different purines and aldehydes. In order to determine the function of conserved amino acides, site directed mutagenesis of amino acides at the active site (Val806Glu, Met884Arg, Glu1265Gln) were introduced and enzyme activity was determined.
Bacterial XDH is highly homologous to the homodimeric mammalian xanthine oxidoreductase - in the amino acid sequence and the secondary and tertiary protein structure as well as the reaction mechanism as described by Leimkühler et al. (2004). Therefore, in the second part of this work, bacterial XDH will be used as a benchmark for mAOX1 during determination of enzyme acitivities using different purines and aldehydes as substrates.
A single monogentic deficit of AO has not been described for humans yet. To identify the biochemical function and to characterize the enzyme in detail a system for a heterologous expression of functionally active hAOX1 in E.coli should be established too.
| Identifer | oai:union.ndltd.org:Potsdam/oai:kobv.de-opus-ubp:4342 |
| Date | January 2008 |
| Creators | Schumann, Silvia |
| Publisher | Universität Potsdam, Mathematisch-Naturwissenschaftliche Fakultät. Institut für Biochemie und Biologie |
| Source Sets | Potsdam University |
| Language | German |
| Detected Language | German |
| Type | Text.Thesis.Doctoral |
| Format | application/pdf |
| Rights | http://opus.kobv.de/ubp/doku/urheberrecht.php |
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