La limitació en l’ús de fungicides per al control de malalties en postcollita de fruita és una
problemàtica d’elevada magnitud en el sector fructícola actual. Degut a això l’ús d’estratègies
alternatives com el control biològic microbià són fonamentals per a la producció de fruita de
qualitat. Malgrat tot, el desenvolupament de programes de biocontrol eficaços requereix d’un
coneixement profund de la capacitat de control i els mecanismes d’acció utilitzats per l’agent
microbià que es pretén emprar, així com de la possibilitat per a què aquest pugui ésser produït
i formulat a nivell comercial. En aquest context, la bactèria Bacillus subtilis soca CPA–8 aïllada
de la superfície de nectarines al Laboratori de Patologia de Postcollita del Centre IRTA
(Lleida) ha demostrat tenir una bona capacitat de biocontrol de malalties de postcollita de
fruita de pinyol. El seu futur ús a nivell comercial depèn de l’estudi del seu potencial de
biocontrol de malalties de postcollita de fruita; així com del desenvolupament de processos
per a l’optimització de la producció i formulació.
La present tesi tenia com a objectiu principal avaluar aspectes clau per al desenvolupament de
B. subtilis CPA–8 com agent efectiu per al control biològic de malalties de postcollita de fruita.
Per a complir amb aquest objectiu, en primer lloc, es va dur a terme una anàlisi detallada de les
característiques biològiques de la soca CPA–8 com ara el seu creixement en medi de cultiu,
producció d’endòspores i substàncies antifúngiques; així com el seu potencial per al control de
malalties importants en postcollita de taronja, poma i fruita de pinyol (Capítol 1). Amb aquests
resultats, el següent pas fou estudiar el mode d’acció utilitzat per B. subtilis CPA–8 per a la
supressió de patògens de postcollita, concretament contra Monilinia spp. causant de la
podridura marró en fruita de pinyol (Capítol 2). Mitjançant la combinació d’eines d‘anàlisi
químic, moleculars i biològiques es van determinar els principals factors implicats en la
capacitat antagònica de la soca CPA–8 contra Monilinia spp. El pas següent fou optimitzar la
producció de B. subtilis CPA–8, en aquest sentit es va desenvolupar un medi de cultiu de baix
cost que proporcionés un creixement alt i mantingués l’eficàcia de biocontrol (Capítol 3).
Primer es van buscar fonts de nitrogen i de carboni econòmiques entre productes comercials i
subproductes agroalimentaris. Posteriorment es va dur a terme l’escalat de la producció de la
bactèria en un bioreactor de 5 L i es va comprovar l’efectivitat per al control de Monilinia spp.
en préssecs. El pas final fou la formulació de B. subtilis CPA–8 mitjançant l’assecat per
atomització (Capítols 4 i 5). Aquest mètode fou seleccionat per dos motius, d’una banda
perquè aquesta és una tècnica d’assecat viable per a formulació de bactèries a baix cost i per
l’altra banda en base als resultats obtinguts en el capítol 1 sobre la capacitat de la bactèria per
produir endòspores resistents al calor i efectives contra patògens de postcollita de fruita.
Primer es va dur a terme un estudi comparatiu de l’efecte de l’atomització sobre la
supervivència de B. subtilis CPA–8 i de l’agent de biocontrol Pantoea agglomerans CPA–2
(Capítol 4). Posteriorment es va realitzar una avaluació de les substàncies protectores/material
de suport més adequades per a l’atomització de la soca CPA–8, i amb els millors productes
atomitzats es van avaluar diferents medis de rehidratació i l’activitat antifúngica; així com la
vida útil y l’efectivitat durant l’emmagatzemament (Capítol 5)
Els resultats obtinguts en el capítol 1 demostraren que B. subtilis CPA–8 produeix cèl lules,
endòspores resistents al calor i compostos que tenen una alta activitat antagònica in vitro
contra els principals patògens de postcollita de fruita Botrytis cinerea, Monilinia laxa, Monilinia
fructicola, Penicillium digitatum, Penicillium italicum i Penicillium expansum. Els tractaments de
cèl lules, endòspores y sobrenedants lliures de cèl lules de la soca CPA–8 mostraren diferents
nivells d’efectivitat per al control de podridures en taronja, poma i fruita de pinyol, presentant
els millors resultats contra Monilinia spp. en préssecs i nectarines amb reduccions de la
incidència de la malaltia fins al 100 %. L’assaig de dosis de diferents tractaments de la soca
CPA–8 a 108, 107 i 106 UFC mL–1 foren efectius contra Monilinia spp. de forma semblant o
millor al Serenade Max®.
L’estudi del mode d’acció de B. subtilis CPA–8 (Capítol 2) va demostrar que els sobrenedants
lliures de cèl lules provinents de cultius líquids tenen una alta activitat antifúngica in vitro
contra Monilinia spp. similar a l’observada amb suspensions cel lulars. Les anàlisis mitjançant
PCR i bioautografia en TLC d’extractes butanòlics d’aquests sobrenedants en comparació
amb els de les soques de referència de B. subtilis UMAF6614 i UMAF6639, van revelar la
producció de les principals famílies de lipopèptids antifúngics coneguts en Bacillus (fengicines,
iturines i surfactines), fet que apuntava l’antibiosi com a principal mecanisme d’acció implicat
en la capacitat de biocontrol de B. subtilis CPA–8. Les fraccions corresponents a les fengicines
foren les responsables de l’activitat inhibitòria de la soca CPA–8 enfront de Monilinia spp.
Aquests resultats van ser corroborats definitivament mitjançant la construcció de mutants de
B. subtilis CPA–8 defectius per a la producció de fengicina interrompent l’expressió del gen
fenB. Les anàlisis per PCR i bioautografia en TLC revelaren que els mutants defectius de la
soca CPA–8 perdien la capacitat d’inhibir a Monilinia spp. per la seva incapacitat per a produir
fengicines. Els assaigs d’efectivitat en fruita utilitzant tractaments provinents dels mutants de
la soca CPA–8 van demostrar que aquests havien perdut la capacitat de controlar la podridura
causada per Monilinia spp. amb percentatges d’incidència similars als observats en el control
sense tractar, mentre que els tractaments amb la soca parental o Serenade Max® presentaven
reduccions de la malaltia de fins el 100 %. Tots aquests resultats demostraren que la producció
de fengicines juga un paper molt important en l’efectivitat de B. subtilis CPA–8 per a controlar
la podridura marró del préssec; i que aquest resulta ser el principal mode d’acció implicat en la
seva capacitat de biocontrol.
En l’optimització de la producció de B. subtilis CPA–8 (Capítol 3) els resultats obtinguts van
demostrar que és possible aconseguir alts nivells de biomassa (superiors a 3×109 UFC mL–1)
emprant dos medis de baix cost composats per farina de soja desengreixada 44 % a 40 g L–1
com a font de nitrogen en combinació amb sacarosa a 20 g L–1 o melassa a 5 g L–1 com a fonts
de carboni. A més a més, la producció de la soca CPA–8 en aquest medi de baix cost va poder
ser escalada a nivell de laboratori en un bioreactor de 5 L de capacitat a 30 °C, amb agitació de
200 rpm i flux d’aire de 100 L h–1, mantenint les concentracions de la bactèria a
3×109 UFC mL–1. Els assaigs en fruita amb tractaments de la soca CPA–8 crescuda en el medi
optimitzat de baix cost van demostrar que aquesta mantenia la seva eficàcia de biocontrol
contra M. fructicola en préssecs amb reduccions de la malaltia de fins al 95 %, similar als tractaments de la bactèria crescuts en medis de laboratori. Les poblacions de CPA–8 van
sobreviure en ferides de préssecs inoculats, independentment dels medis de cultiu utilitzats.
Aquests resultats proporcionen una base fiable per a la producció de la soca CPA–8 a nivell
industrial.
En la formulació de B. subtilis CPA–8 mitjançant assecat per atomització (Capítols 4 i 5) els
resultats demostraren que aquesta bactèria és capaç de sobreviure a les altes temperatures del
procés (32.3 % de viabilitat i 3.3×109 UFC g–1 de concentració final de producte), comparada
amb P. agglomerans CPA–2 utilitzada com a model de bactèria sensible a la calor i no
formadora d’endòspores que no fou resistent (menys del 2 % de viabilitat). La supervivència
de la soca CPA–8 a l’atomització va estar directament relacionada amb la seva capacitat per a
produir endòspores resistents a les altes temperatures. La resistència a la calor de la soca
CPA–8 a més a més va dependre de la fase de creixement, essent el cultiu de 72 h, més
resistent que el de 24 h, probablement pel seu major contingut d’endòspores.
Els resultats obtinguts en l’estudi de la substància protectora/material de suport més adequada
per a l’atomització de B. subtilis CPA–8 van demostrar que quatre diferents combinacions de
llet desnatada en pols i MgSO4 proveïen una bona recuperació de pols (28–38 %) i continguts
d’humitat del 7–13 %. La supervivència de la soca CPA–8 fou diferent en els atomitzats dels
cultius de 24 i 72 h. Les formulacions de 72 h mostraven una major supervivència (28–32 %)
y amb concentracions finals al voltant d’1.6–3.3×109 UFC g–1, mentre que la viabilitat dels
atomitzats de 24 h fou inferior a l’1 %, fet pel qual les primeres van seleccionar–se per a la
seva posterior avaluació. Diferents rehidratants como l’aigua o el tampó fosfat van
proporcionar una bona recuperació de cèl lules viables en les formulacions de CPA–8 similars
a les obtingudes amb llet desnatada en pols o sacarosa al 10 % amb el que es dedueix que
l’aigua pot utilizar–se com a rehidratant amb l’avantatge a nivell pràctic que això suposa.
L’estudi de la vida útil de les formulacions de la soca CPA–8 emmagatzemades a 4 °C (fred) i
a 20 °C (temperatura ambient) va demostrar que la viabilitat es mantenia o disminuïa
lleugerament (0.2–0.3 log) durant 6 mesos d’emmagatzematge. A més a més, després de 4 i
6 mesos de conservació aquestes formulacions controlaven la podridura marró causada per
Monilinia spp. en nectarines i préssecs mostrant reduccions de la incidència de la malaltia entre
el 90 i 100 %. Els resultats obtinguts van demostrar que l’atomització podria ser un mètode
d’assecat adequat per a obtenir formulacions estables i efectives de B. subtilis CPA–8.En conclusió els estudis realitzats en aquesta tesi demostren el potencial de l’antagonista
B. subtilis CPA–8 per al control de malalties de postcollita de fruita i estableixen les bases per a
la seva posterior implementació de la producció i formulació a nivell comercial. / La limitación en el uso de fungicidas para el control de enfermedades en postcosecha de fruta
es un grave problema en el sector frutícola actual. Debido a esto, el uso de estrategias
alternativas como el control biológico microbiano son fundamentales para la producción de
fruta de calidad. Sin embargo, el desarrollo de programas de biocontrol eficaces requiere de un
fuerte conocimiento de la capacidad de control y los mecanismos de acción usados por el
agente microbiano que se pretende emplear, así como de la posibilidad para que éste pueda
ser producido y formulado a nivel comercial. En este contexto, la bacteria Bacillus subtilis cepa
CPA–8 aislada de la superficie de nectarinas en el Laboratorio de Patología de Postcosecha del
Centro IRTA (Lleida) ha demostrado tener una importante capacidad de biocontrol de
enfermedades de postcosecha de fruta de hueso. Su futuro uso a nivel comercial depende del
estudio de su potencial de biocontrol de enfermedades de postcosecha de fruta; así como del
desarrollo de procesos para su óptima producción y formulación.
La presente tesis tiene como objetivo fundamental evaluar aspectos clave para el desarrollo de
B. subtilis CPA–8 como agente eficaz de control biológico de enfermedades de postcosecha de
fruta. Para cumplir con este objetivo, en primer lugar, se realizó un análisis detallado de las
características biológicas de la cepa CPA–8 como su crecimiento en medio de cultivo,
producción de endosporas y sustancias antifúngicas; así como su potencial para el control de
importantes podredumbres de postcosecha de naranja, manzana y fruta de hueso (Capítulo 1).
Con estos resultados el siguiente paso fue estudiar el modo de acción usado por B. subtilis
CPA–8 para la supresión de patógenos de postcosecha, concretamente contra Monilinia spp.
causante de la podredumbre marrón en fruta de hueso (Capítulo 2). Mediante la combinación
de herramientas de análisis químico, molecular y biológico se determinaron los principales
factores implicados en la capacidad antagónica de la cepa CPA–8 contra Monilinia spp. El
siguiente paso fue optimizar la producción de B. subtilis CPA–8, para lo cual se desarrolló un
medio de cultivo de bajo coste que proporcionase un crecimiento alto y mantuviese la eficacia
de biocontrol (Capítulo 3). Primero se buscaron fuentes de nitrógeno y carbono económicas
entre productos comerciales y subproductos agroalimentarios. Posteriormente se realizó el
escalado de producción de la bacteria en un bioreactor de 5 L y se comprobó la efectividad
para el control de Monilinia spp. en melocotones. El paso final fue la formulación de B. subtilis
CPA–8 mediante secado por atomización (Capítulos 4 y 5). Este método fue seleccionado por
dos motivos, por un lado porque ésta es una técnica de secado viable para formulación de
bacterias a bajo coste y en base a los resultados obtenidos en el capítulo 1 sobre la capacidad
de la bacteria para producir endosporas resistentes al calor y eficaces contra patógenos de
postcosecha de fruta. Primero se realizó un estudio comparativo del efecto de la atomización
sobre la supervivencia de B. subtilis CPA–8 y del agente de biocontrol Pantoea agglomerans
CPA–2 (Capítulo 4). Posteriormente se realizó una evaluación de las sustancias
protectoras/material de soporte más adecuadas para la atomización de la cepa CPA–8, y de
los mejores productos atomizados se evaluaron los distintos medios de rehidratación y la
actividad antifúngica; así como su vida útil y efectividad durante conservación (Capítulo 5).Los resultados obtenidos en el capítulo 1 indicaron que B. subtilis CPA–8 produce células,
endosporas resistentes al calor y compuestos que tienen una alta actividad antagónica in vitro
contra los principales patógenos de postcosecha de fruta Botrytis cinerea, Monilinia laxa,
Monilinia fructicola, Penicillium digitatum, Penicillium italicum y Penicillium expansum. Los tratamientos
de células, endosporas y sobrenadantes libres de células de la cepa CPA–8 mostraron
diferentes niveles de efectividad para el control de podredumbres en naranja, manzana y fruta
de hueso, presentando los mejores resultados contra Monilinia spp. en fruta de hueso con
reducciones de la incidencia de la enfermedad hasta del 100 %. El ensayo de dosis de
diferentes tratamientos de la cepa CPA–8 a 108, 107 y 106 UFC mL–1 fueron efectivos contra
Monilinia spp., de forma similar o mejor que Serenade Max®.
El estudio del modo de acción de B. subtilis CPA–8 (Capítulo 2) demostró que los
sobrenadantes libres de células provenientes de cultivos líquidos tenían una alta actividad
antifúngica in vitro contra Monilinia spp. similar a la observada con suspensiones celulares. Los
análisis mediante PCR y bioautografía en TLC de extractos butanólicos de estos
sobrenadantes en comparación con los de las cepas de referencia de B. subtilis UMAF6614 y
UMAF6639, revelaron la producción de las principales familias de lipopéptidos antifúngicos
conocidos en Bacillus (fengicinas, iturinas y surfactinas), lo que apuntó a la antibiosis como el
principal mecanismo de acción implicado en la capacidad de biocontrol de B. subtilis CPA–8.
Las fracciones correspondientes a las fengicinas fueron las responsables de la actividad
inhibitoria de la cepa CPA–8 frente a Monilinia spp. Estos resultados fueron definitivamente
corroborados mediante la construcción de mutantes de B. subtilis CPA–8 defectivos para la
producción de fengicina interrumpiendo la expresión del gen fenB. Los análisis por PCR y
bioautografía en TLC revelaron que los mutantes defectivos de la cepa CPA–8 perdieron la
capacidad de inhibir a Monilinia spp. por su incapacidad para producir fengicinas. Los ensayos
de efectividad en fruta utilizando tratamientos provenientes de los mutantes de la cepa CPA–8
demostraron que éstos habían perdido su capacidad para controlar la podredumbre causada
por Monilinia spp. con porcentajes de incidencia similares a los observados en el control sin
tratar, mientras que los tratamientos con la cepa parental o Serenade Max® presentaron
reducciones de enfermedad de hasta el 100 %. Todos estos resultados demostraron que la
producción de fengicinas juega un papel muy importante en la efectividad de B. subtilis CPA–8
para controlar la podredumbre marrón del melocotón; y que éste resulta ser el principal
mecanismo de acción implicado en su capacidad de biocontrol.
En la optimización de la producción de B. subtilis CPA–8 (Capítulo 3) los resultados
obtenidos demostraron que se pueden conseguir altos niveles de biomasa (superiores a
3×109 UFC mL–1) usando dos medios de bajo coste compuestos por harina de soja
desengrasada 44 % a 40 g L–1 como fuente de nitrógeno en combinación con sacarosa a
20 g L–1 o melaza a 5 g L–1 como fuentes de carbono. Además la producción de la cepa CPA–8
en este medio de bajo coste pudo ser escalada a nivel de laboratorio en un bioreactor de 5 L
de capacidad a 30 °C, con agitación de 200 rpm y flujo de aire de 100 L h–1, manteniendo las
concentraciones de la bacteria a 3×109 UFC mL–1. Los ensayos en fruta con tratamientos de la
cepa CPA–8 crecida en el medio optimizado de bajo coste demostraron que ésta mantenía su eficacia de biocontrol contra M. fructicola en melocotones con reducciones de enfermedad de
hasta el 95 %, similar a los tratamientos de la bacteria crecidos en medios de laboratorio. Las
poblaciones de CPA–8 sobrevivieron en heridas de melocotones inoculados,
independientemente de los medios de cultivo utilizados. Estos resultados proporcionan una
base fiable para la producción de la cepa CPA–8 a nivel industrial.
En la formulación de B. subtilis CPA–8 mediante secado por atomización (Capítulos 4 y 5) los
resultados demostraron que esta bacteria es capaz de sobrevivir a las altas temperaturas del
proceso (32.3 % de viabilidad y 3.3×109 UFC g–1 de concentración final de producto),
comparado con P. agglomerans CPA–2 utilizada como modelo de bacteria sensible al calor y no
formadora de endosporas que no fue resistente (menos del 2 % de viabilidad). La
supervivencia de la cepa CPA–8 a la atomización estuvo directamente relacionada con su
capacidad para producir endosporas resistentes a las altas temperaturas. La resistencia al calor
de la cepa CPA–8 además dependió de la fase de crecimiento, siendo el cultivo de 72 h, más
resistente que el de 24 h, probablemente por su mayor contenido de endosporas.
Los resultados obtenidos en el estudio de la sustancia protectora/material de soporte más
adecuada para la atomización de B. subtilis CPA–8 demostraron que cuatro diferentes
combinaciones de leche desnatada en polvo y MgSO4 proveían una buena recuperación de
polvo (28–38 %) y contenidos de humedad del 7–13 %. La supervivencia de la cepa CPA–8
varió considerablemente en los atomizados con los cultivos de 24 h y los de 72 h. Las
formulaciones de 72 h mostraron una mayor supervivencia (28–32 %) y con concentraciones
finales entorno a 1.6–3.3×109 UFC g–1, mientras que la viabilidad de los atomizados de 24 h
fue inferior al 1 %, por lo cual se seleccionaron para su posterior evaluación. Diferentes
rehidratantes como el agua o tampón fosfato proporcionaron una buena recuperación de
células viables en las formulaciones de CPA–8 similares a las obtenidas en leche desnatada en
polvo o sacarosa al 10 % por lo que el agua puede utilizarse como rehidratante con la ventaja
a nivel práctico que supone. El estudio de la vida útil de las formulaciones de la cepa CPA–8
almacenadas a 4 °C (frío) y a 20 °C (temperatura ambiente) demostró que la viabilidad se
mantuvo o disminuyó ligeramente entorno a 0.2–0.3 log durante 6 meses de almacenamiento.
Además después de 4 y 6 meses de almacenamiento estas formulaciones controlaron la
podredumbre marrón causada por Monilinia spp. en nectarinas y melocotones mostrando
reducciones de la incidencia de la enfermedad entre el 90 y 100 %. Los resultados obtenidos
demostraron que la atomización podría ser un método de secado adecuado para obtener
formulaciones estables y eficaces de B. subtilis CPA–8.
En conclusión los estudios realizados en esta tesis demuestran el potencial del agente de
biocontrol B. subtilis CPA–8 para el control de enfermedades de postcosecha de fruta y sientan
las bases para su posterior implementación de la producción y formulación a nivel comercial / Synthetic fungicides are the primary means to reduce losses caused by postharvest
diseases. However, public concern for their negative impact on human health and
environment associated with undesirable chemical residues on fruit and proliferation of
fungicide–resistant isolates have impelled the search for alternative methods. Biological
control using microorganisms has emerged as an effective alternative to control postharvest
diseases and to produce quality fruit free of fungicide residues. However, the development
of a successful biocontrol product requires a strong knowledge about the antagonistic
ability and mechanisms of action used by the microbial agent to disease suppression and the
possibility for its production and formulation to commercial application. In this context,
Bacillus subtilis strain CPA–8 isolated from nectarines surface in the Postharvest Pathology
Laboratory from IRTA centre (Lleida) has shown a significant capacity for biocontrol of
postharvest diseases of stone fruit. Its future use on a commercial level depends on its
antagonistic potential to control fruit postharvest diseases as well as an optimum
production and formulation systems.
This thesis has the main objective to evaluate key aspects involved in development of
B. subtilis CPA–8 as an effective biocontrol agent of postharvest diseases on fruit. To
achieve this objective, first, the CPA–8 growth and production of endospores and
antifungal substances were characterized. Then, biocontrol potential of B. subtilis CPA–8
was tested against the main postharvest decay on oranges, apples and stone fruit
(Chapter 1). Based on these results, the mechanism of action used by CPA–8 to suppress
postharvest pathogens, particularly against Monilinia spp. causing brown rot in stone fruit
was studied (Chapter 2). Based on chemical, molecular and biological analysis the key
factors involved in the biocontrol activity of CPA–8 against Monilinia spp. were identified.
Next step was optimizing B. subtilis CPA–8 production by developing a low cost medium
that provide maximum bacterium growth and maintain its biocontrol efficacy (Chapter 3).
First, different media combining economical nitrogen and carbon sources from commercial
products and by–products were evaluated. Second, CPA–8 production was scaled up in a
5–liter bioreactor and the efficacy to control of Monilinia spp. in peaches was evaluated. The
final step was B. subtilis CPA–8 formulation by spray drying (Chapters 4 and 5). This
method was selected because it is a cost effective technique for bacteria preservation and
results of Chapter 1 indicated that CPA–8 was heat resistant by endospores production
capacity. These endospores had also demonstrated good antifungal activity against fruit
postharvest pathogens. First, the role of endospore production by B. subtilis CPA–8 on its
survival to spray–drying process was investigated by comparing CPA–8 with the biocontrol
agent Pantoea agglomerans CPA–2 as model of heat–sensitive and non–spore forming
bacterium (Chapter 4). Finally, carriers/protectants were evaluated to prepare CPA–8 formulations by spray drying; and with the best CPA–8 formulations rehydration media,
shelf life stability and biocontrol efficacy during storage were evaluated (Chapter 5).
The results obtained in Chapter 1 indicated that CPA–8 produces cells, heat–resistant
endospores and compounds with high antifungal activity in vitro against the major fruit
postharvest pathogens Botrytis cinerea, Monilinia laxa, Monilinia fructicola, Penicillium digitatum,
Penicillium italicum and Penicillium expansum. Treatment of cells, endospores and cell–free
supernatants of CPA–8 showed different efficacy levels to control fugal decay on oranges,
apples and stone fruit, obtaining the best results against Monilinia spp. on stone fruit with
disease reductions up to 100%. Dose tests demonstrated that different CPA–8 treatments at
108, 107 and 106 CFU mL–1 were effective against Monilinia spp., similar or better than
Serenade Max®, a commercial biocontrol product based in a B. subtilis strain. Experimental
evidence suggested that B. subtilis CPA–8 has biocontrol potential to control postharvest
diseases on several fruit types, particularly against peach brown rot.
The mode of action study (Chapter 2) showed that cell free supernatants and butanolic
extracts from liquid cultures of B. subtilis CPA–8 had a strong antifungal activity in vitro
against Monilinia spp. similar to that observed with cell suspensions. Fengycin, iturin and
surfactin lipopeptides were identified by TLC in butanolic extracts from cell free
supernatants of CPA–a by comparison with the B. subtilis reference strains UMAF6614 and
UMAF6639, indicating that antibiosis could be the major factor involved in the CPA–8
biological control ability. TLC–bioautography analysis showed that CPA–8 antifungal
activity was associated only with fengycin lipopeptide. These results were definitively
supported by mutagenesis analysis targeted to suppress fengycin biosynthesis by disruption
of the fenB gene. PCR and TLC–bioautography analysis allowed to identify CPA–8
transformants with reduced or suppressed antifungal activity and to select the defective
phenotype associated with the lack of fengycin bands. Fruit trials confirmed that
fengycin–defective mutants lost their ability to control peach brown rot disease in
comparison with CPA–8 wild type strain or Serenade Max®. Taken together our data
indicate that fengycin–like lipopeptides play a major role in the biological control
potential of B. subtilis CPA–8 against peach brown rot.
The results obtained in Chapter 3 indicate that high production levels of B. subtilis CPA–8
(>3×109 CFU mL–1) could be achieved in a low cost medium based on defatted soy flour
44 % (40 g L–1) with sucrose (20 g L–1) or molasses (5 g L–1). CPA–8 production in the
optimized low cost medium was scaled–up in a 5–L bioreactor at 30 °C under shaking at
200 rpm and with air flow of 100 L h–1 and production was maintained around 3×109
CFU mL–1. Fruit trials with cells and cell free supernatants obtained from CPA–8 grown in
optimized medium maintained biocontrol efficacy against M. fructicola in peaches showing
disease reduction up to 95 %, similar to the treatment from bacterium grown in expensive
laboratory media. CPA–8 populations survived in wounds on inoculated peaches, regardless of the culture media used. The results could be used to provide a reliable basis for the
fermentation scaling–up process to an industrial level.
The results obtained in Chapters 4 and 5 indicate that B. subtilis CPA–8 is heat resistant to
high temperatures involved in spray–drying process by endospore production comparing
with the heat sensitive and non–spore forming P. agglomerans CPA–2. The 72–h–old CPA–8
cultures spray–dried showed the best survival with 32.3 % viable cells recovery and a final
concentration product of 3.3×109 CFU g–1, while CPA–2 viability was lower than 2 %.
Heat resistance of CPA–8 was also depending on growth time, being 72–h–old culture more
resistant than 24–h–old culture, probably due to the higher content of endospores. These
results suggest that endospore production improves CPA–8 resistance to spray–drying
formulation system.
The study of carriers/protectants addition in spray–drying CPA–8 formulations showed
that four different combinations of skim milk and MgSO4 provided reasonable recovery
powder (28–38 %) and moisture content (7–13 %). CPA–8 survival varied considerably
among spray–dried 24– and 72–h–old formulations. The 72 h–old CPA–8 culture spray
dried showed the highest survival (28–32 %) and a final concentration product of 1.6–3.3×109
CFU g–1, while viability of 24 h–old culture formulations were lower than 1 %. Rehydration
media as water or phosphate buffer provided good recovery of dried cells from CPA–8
formulations as well as skim milk or sucrose both at 10%. This result is a practical
advantage. CPA–8 formulations after 4 and 6 month of storage at 4 ºC (cold) or at 20 ºC
(room temperature) maintained survival and efficacy to control brown rot caused by
Monilinia spp. on nectarines and peaches achieving disease incidence reductions among 90
and 100 %. Spray drying could be considered a suitable method to obtain stable and
effective formulations of B. subtilis CPA–8.
In conclusion, the studies in this thesis demonstrated the biocontrol potential of B. subtilis
CPA–8 to control postharvest diseases of fruit and established the bases for subsequent
implementation of production and formulation at commercial level.
| Identifer | oai:union.ndltd.org:TDX_UDL/oai:www.tdx.cat:10803/80456 |
| Date | 18 January 2012 |
| Creators | Yánez Mandizábal, Viviana del Rocío |
| Contributors | Teixidó i Espasa, Neus, Viñas Almenar, Inmaculada, Universitat de Lleida. Departament de Tecnologia d'Aliments |
| Publisher | Universitat de Lleida |
| Source Sets | Universitat de Lleida |
| Language | Spanish |
| Detected Language | Spanish |
| Type | info:eu-repo/semantics/doctoralThesis, info:eu-repo/semantics/publishedVersion |
| Format | 157 p., application/pdf |
| Source | TDX (Tesis Doctorals en Xarxa) |
| Rights | info:eu-repo/semantics/openAccess, ADVERTIMENT. L'accés als continguts d'aquesta tesi doctoral i la seva utilització ha de respectar els drets de la persona autora. Pot ser utilitzada per a consulta o estudi personal, així com en activitats o materials d'investigació i docència en els termes establerts a l'art. 32 del Text Refós de la Llei de Propietat Intel·lectual (RDL 1/1996). Per altres utilitzacions es requereix l'autorització prèvia i expressa de la persona autora. En qualsevol cas, en la utilització dels seus continguts caldrà indicar de forma clara el nom i cognoms de la persona autora i el títol de la tesi doctoral. No s'autoritza la seva reproducció o altres formes d'explotació efectuades amb finalitats de lucre ni la seva comunicació pública des d'un lloc aliè al servei TDX. Tampoc s'autoritza la presentació del seu contingut en una finestra o marc aliè a TDX (framing). Aquesta reserva de drets afecta tant als continguts de la tesi com als seus resums i índexs. |
Page generated in 0.0064 seconds