Anti-Neutrophile Cytoplasmatische Antikörper verursachen nekrotisierende Vaskulitiden kleiner Blutgefäße. Die Serinprotease PR3 ist ein ANCA-Zielantigen, welches von zirkulierenden ANCA auf der Zellmembran erkannt wird. ANCA aktivieren neutrophile Granulozyten, die dann die nekrotisierende Vaskulitis verursachen. Das Membran-PR3 Expressionsmuster ist bimodal wobei mPR3-niedrig- und mPR3-hoch-exprimierende Zellen existieren. Wir testeten die Hypothese, dass ein Membranrezeptor eine hohe mPR3-Expression vermittelt. Wir verwendeten humane neutrophile Granulozyten, neutrophil-differenzierte Stammzellen und transfizierte HEK293 Zellen. Wir identifizierten das Glykoprotein CD177 als einen mPR3-präsentierenden Rezeptor. CD177 zeigte eine spezifische Bindung von reifem PR3-Protein, nicht aber von einem unprozessierten PR3. Wir separierten die mPR3-Zellpopulationen und führten Durchflusszytometrie, Giemsa-Färbung, Western Blot-Experimente und RT-PCR für die PR3 und CD177 mRNA-Expression durch. Wir fanden, dass die mPR3hoch neutrophilen Granulozyten PR3- und CD177-Protein enthielten, während in den mPR3niedrig neutrophilen Granulozyten nur PR3, aber kein CD177 detektierbar war. Die CD177-Regulation vollzog sich auf transkriptioneller Ebene, da die Zellen, die negativ für das CD177-Protein waren auch keine mRNA transkribierten. Um die Grundlage der fehlenden CD177-Transkription zu analysieren, identifizierten wir den Transkriptionsstart von CD177 für eine anschließende Mutations- und SNP-Analyse. Die CD177-Sequenzen der proteinkodierenden Regionen und der Intron-Exon-Übergänge der beiden Zellpopulationen waren identisch. Jedoch fanden wir, dass das CD177-Gen einer monoallelischen Expression unterliegt. Es wurde dabei maternale als auch paternale monoallelische Expression detektiert. In weiterführenden Untersuchungen soll der Regulationsmechanismus der monoallelischen CD177-Expression charakterisiert werden. / Anti-Neutrophil Cytoplasmic Antibodies cause necrotizing small-vessel vasculitis. The serine protease PR3 provides a main ANCA target antigen and is recognized by circulating ANCA on the neutrophil cell surface. ANCA activate neutrophils and activated neutrophils cause vasculitis. The membrane-PR3 expression pattern is bimodal in that low and high mPR3 expressing cells can be distinguished. We tested the hypothesis that a membrane receptor mediates mPR3high expression. We studied human neutrophils, neutrophilic differentiated CD34-positive hematopoietic stem cells and transfected HEK293 cells. We identified the glycoprotein CD177 as an mPR3 presenting receptor. CD177 demonstrated specific binding of mature, but not of unprocessed pro-PR3. We separated the two mPR3 populations and performed cytometry analysis, Giemsa staining, western blot analysis and RT-PCR for PR3 and CD177 expression. We detected PR3 and CD177 protein in mPR3high expressing neutrophils, whereas only PR3, but no CD177 was found in mPR3low expressing cells. Regulation took place on a transcriptional level because cells that were negative for CD177 protein were also negative for mRNA. To further study this finding, we identified the CD177 transcription start for a subsequent mutation and SNP analysis. CD177 sequences of the protein-coding regions and the intron-exon regions did not differ in both populations. However, we found a monoallelic CD177 expression and were able to detect maternal as well as paternal allele expression. Future experiments will elucidate the mechanisms that control monoallelic CD177 gene expression.
| Identifer | oai:union.ndltd.org:HUMBOLT/oai:edoc.hu-berlin.de:18452/17492 |
| Date | 07 November 2013 |
| Creators | Eulenberg, Claudia |
| Contributors | Börner, Thomas, Bader, Michael, Kettritz, Ralph |
| Publisher | Humboldt-Universität zu Berlin, Mathematisch-Naturwissenschaftliche Fakultät I |
| Source Sets | Humboldt University of Berlin |
| Language | German |
| Detected Language | English |
| Type | doctoralThesis, doc-type:doctoralThesis |
| Format | application/pdf |
| Rights | Namensnennung - Keine kommerzielle Nutzung - Keine Bearbeitung, http://creativecommons.org/licenses/by-nc-nd/3.0/de/ |
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