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Previous issue date: 2014 / Funda??o de Amparo ? Pesquisa do estado de Minas Gerais (FAPEMIG) / O objetivo desse trabalho foi desenvolver um imunosensor fundamentado em espectroscopia de resson?ncia de pl?smons de superf?cie (SPR) para a detec??o de anticorpos anti-Trypanosoma cruzi por meio da imobiliza??o de ant?genos brutos do parasito em monocamadas auto-organizadas mistas (SAMs) formadas por ?cido 11-mercaptoundecan?ico (11-MUA) e ?cido 3-mercaptopropi?nico (3-MPA). Na sua constru??o, as concentra??es de cada alcanotiol, bem como a propor??o de cada um deles na composi??o das SAMs mistas foram definidas atrav?s de c?lculos de cobertura de superf?cie Posteriormente, o ant?geno em diferentes concentra??es foi imobilizado sobre as SAMs mistas ativadas constru?das em disco de ouro e, a varia??o do ?ngulo de SPR (??SPR) decorrente dessa etapa foi monitorada em tempo real. O imunosensor desenvolvido foi ent?o eletroquimicamente caracterizado por voltametria c?clica (VC) e espectroscopia de imped?ncia eletroqu?mica (EIE) e as respostas do mesmo frente a um pool de soros de indiv?duos infectados e n?o infectados pelo T. cruzi foram avaliadas. Em seguida, foram determinados par?metros para otimiza??o do dispositivo, incluindo tempo de imobiliza??o e concentra??o do ant?geno, bloqueio e regenera??o da superf?cie sensora e tempo envolvido nas an?lises do imunoensaio. Por fim, a dilui??o de trabalho do soro e o ponto de corte do imunosensaio foram escolhidos e os ?ndices de desempenho do mesmo como t?cnica para o imunodiagn?stico da DC foram calculados empregando 171 soros, sendo 99 de indiv?duos infectados pelo T. cruzi, 30 de n?o infectados e 42 portadores de outras infec??es. Os maiores valores de foram encontrados para a concentra??o 1.0 mmol L-1 de 11-MUA e 3-MPA e para as SAMs mistas formadas na propor??o de 1:10. A imobiliza??o dos ant?genos foi conduzida com ?xito, de modo que houve linearidade entre a concentra??o utilizada e o ??SPR. Por VC e EIE, foi demonstrado que a liga??o covalente das prote?nas aumentou a resist?ncia ? transfer?ncia eletr?nica quando comparado com o comportamento da sonda eletroqu?mica sobre as SAMs mistas. Ademais, o imunosensor se mostrou, semelhante ao ELISA, capaz de detectar anticorpos anti-T. cruzi em amostras de soros dilu?das at? 1280 vezes. J? em rela??o aos soros negativos, o dispositivo detectou ??SPR significativas apenas at? a dilui??o 1:160, o que demonstrou razo?vel capacidade do m?todo em distinguir indiv?duos infectados de n?o infectados. Dentre os par?metros anal?ticos avaliados ficou definido o tempo de imobiliza??o e a concentra??o do ant?geno em 20 minutos e 30 ?g mL-1, o bloqueio da superf?cie por 10 minutos com solu??o de BSA 1.0%, a regenera??o pela inje??o de SDS 1.0% e o tempo de avalia??o da resposta do dispositivo em 20 minutos. A dilui??o do soro em 1:320 e o ponto de corte a 17.2 m? foram os crit?rios metodol?gicos definidos para o imunosensaio. Os ?ndices de desempenho calculados determinaram um excelente potencial do imunosensor no diagn?stico sorol?gico da doen?a de Chagas, com valores de sensibilidade de 100%, especificidade de 97.2%, valor preditivo positivo igual a 98%, valor preditivo negativo de 100% e acur?cia global estimada em 99.6%. O n?mero de rea??es cruzadas em soros de indiv?duos com leishmaniose visceral foi menor no m?todo proposto (1/7) do que no ELISA (6/7). A partir dos resultados ? poss?vel afirmar que foi desenvolvido com ?xito um imunosensor sens?vel, espec?fico, r?pido, simples e de f?cil execu??o para o diagn?stico sorol?gico da doen?a de Chagas. / Disserta??o (Metrado) ? Programa de P?s-gradua??o em Ci?ncias Farmac?uticas, Universidade Federal dos Vales do Jequitinhonha e Mucuri, 2014. / ABSTRACT
The aim of the present study was to describe the development of an unpublished SPR-based immunosensor for detection of anti-T. cruzi antibodies in human serum through the covalently immobilized T. cruzi antigen on a mixed SAM of 11-mercaptoundecanoic acid (11-MUA) and 3-mercaptopropionic acid (3-MPA) on a SPR sensor chip. In its construction, the concentrations of each alkanethiol, and the proportion of each in the composition of the mixed SAMs were defined by calculation of surface coverage Subsequently, the antigen at different concentrations was immobilized on the activated mixed SAMs built on gold disc, and the change in the SPR angle (??SPR) resulting from this step was monitored in real time. The imunosensor developed was electrochemically characterized by cyclic voltammetry (CV) and electrochemical impedance spectroscopy (EIS), and the responses of a pool of sera from individuals infected and not infected with T. cruzi were also evaluated. Then, some parameters for the optimization of the device were defined, including immobilization time and antigen concentration, blocking and regeneration of the sensor surface and time involved in the analysis of the immunoassay. Finally, the working dilution of the serum and the cut-off point were chosen and the performance indices of the technique were calculated using 171 sera - 99 individuals infected with T. cruzi, 30 not infected and 42 with other infections. The highest values ??of ? were found for the 1.0 mmol L-1 concentration of 11-MUA and 3-MPA and mixed SAMs formed at 1:10 proportion. The immobilization of antigens was conducted successfully, so there was linearity between the concentration used and ??SPR. For VC and EIS has been demonstrated that covalent attachment of the protein increased the electron transfer resistance when compared with the behavior of the electrochemical probe on the mixed SAMs. Furthermore, imunosensor showed, similarity to ELISA, capable of detecting anti-T. cruzi in sera diluted up 1280 times. In relation to the negative sera, the device detected significant ??SPR only until dilution 1:160, which demonstrated the ability of the method to distinguish infected from uninfected individuals. The following analytical parameters were defined: time of immobilization and antigen concentration at 20 minutes and 30 mg mL-1, blocking surface for 10 minutes with 1.0% BSA solution, regeneration by injection of 1.0% SDS and time evaluation of the response of the device in 20 minutes. The serum dilution at 1:320 and cut-off point at 17.2 m? were the methodological criteria for immunoassay. The performance indices calculated for the imunosensor demonstrated a great potential in serological diagnosis of Chagas' disease, with a sensitivity of 100%, specificity of 97.2%, positive predictive value of 98%, negative predictive value of 100% and global accuracy estimated in 99.6%. The number of cross-reactivity with sera from individuals with visceral leishmaniasis was lower (1/7) than in ELISA (6/7). Based on the results, it is possible to stay that a sensitive, specific, rapid, simple and easy immunosensor was successfully with potential application at serological diagnosis of Chagas disease.
| Identifer | oai:union.ndltd.org:IBICT/oai:acervo.ufvjm.edu.br/jspui:1/355 |
| Date | January 2014 |
| Creators | Luz, Jo?o Gabriel Guimar?es |
| Contributors | Martins Filho, Olindo de Assis, Santos, Wallans Torres Pio dos, Damos, Flavio Santos, Universidade Federal dos Vales do Jequitinhonha e Mucuri (UFVJM), Martins, Helen Rodrigues |
| Publisher | UFVJM |
| Source Sets | IBICT Brazilian ETDs |
| Language | Portuguese |
| Detected Language | English |
| Type | info:eu-repo/semantics/publishedVersion, info:eu-repo/semantics/masterThesis |
| Source | reponame:Repositório Institucional da UFVJM, instname:Universidade Federal dos Vales do Jequitinhonha e Mucuri, instacron:UFVJM |
| Rights | A concess?o da licen?a deste item refere-se ao ? termo de autoriza??o impresso assinado pelo autor, assim como na licen?a Creative Commons, com as seguintes condi??es: Na qualidade de titular dos direitos de autor da publica??o, autorizo a Universidade Federal dos Vales do Jequitinhonha e Mucuri e o IBICT a disponibilizar por meio de seus reposit?rios, sem ressarcimento dos direitos autorais, de acordo com a Lei n? 9610/98, o texto integral da obra disponibilizada, conforme permiss?es assinaladas, para fins de leitura, impress?o e/ou download, a t?tulo de divulga??o da produ??o cient?fica brasileira, e preserva??o, a partir desta data., info:eu-repo/semantics/openAccess |
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