El primer objetivo de este estudio fue determinar los mecanismos de utilización energética de diferentes monosacáridos (glucosa, fructosa, manosa y sorbitol), por parte de los espermatozoides de cerdo. Para ello, los espermatozoides fueron incubados sin ningún sustrato energético y con diferentes hexosas. Las concentraciones utilizadas de las hexosas fueron de 10 mM, siempre que se quería determinar el efecto del tiempo de incubación, y de 1mM, 5mM, 10mM, 20 mM, 50mM cuando lo que se pretendía determinar era el efecto de la concentración del sustrato metabolizable. Las incubaciones se realizaron durante 5 min., 15 min., 30 min., y 60 min., para el caso del efecto tiempo, y durante 60 minutos para analizar el efecto concentración. Las incubaciones fueron realizadas en un medio de Krebs-Ringer-Henseleit carente de substratos energéticos. Tras estas incubaciones, se determinaron tanto la viabilidad como el estado de los acrosomas como marcadores funcionales del estado de los espermatozoides. También se determinaron los niveles intracelulares de algunos metabolitos energéticos, como la glucosa 6-fosfato, el glucógeno y el trifosfato de adenosina (ATP). Además, también se midió el ritmo de formación de L-lactato extracelular proveniente de la glucólisis y el de CO2 como producto final del ciclo de Krebs. La conclusión más relevante extraída de este estudio fue que la glucosa es el monosacárido utilizado preferentemente por los espermatozoides de cerdo. Esta glucosa es metabolizada principalmente por la vía glucolítica (en un 99%). Finalmente, el control de la vía de consumo de la glucosa se realiza básicamente en dos puntos, el primero la modulación de la actividad hexoquinasa, y el segundo la modulación de la actividad piruvato quinasa.Como complementación del estudio anterior, también se estudió el comportamiento cinético de las principales actividades enzimáticas que controlan la ruta glucolítica, como son la hexoquinasa, que regula la fosforilación inicial de los monosacáridos, y la piruvato quinasa, que regula la introducción del producto final de la glucólisis en el ciclo de Krebs. Estos estudios mostraron que la hexoquinasa tiene una afinidad muy superior hacia la glucosa cuando la comparamos con los otros monosacáridos estudiados, mientras que la piruvato quinasa muestra una gran dependencia en su actividad del equilibrio intracelular entre los niveles de bifosfato de adenosina (ADP) y de ATP, lo que permite un control muy sensible de la obtención de energía a través del flujo glucolítico. Finalmente, también se evaluó el patrón de fosforilación en residuos de tirosina en los espermatozoides de cerdo. Los extractos celulares mostraron un patrón uniforme, con una banda de fosforilación mayoritaria a 45 Kda de peso. Este patrón no sufrió cambios significativos tras la incubación con cualquiera de los azúcares. Este resultado indica la falta de una acción moduladora específica de los azúcares sobre la funcionalidad espermática porcina.Otro de los objetivos consistió en evaluar la utilización de sustratos no glucolisables, y por lo tanto, no utilizables a través de la glucólisis, para la obtención de energía como el citrato y el lactato por parte de los espermatozoides de cerdo. El diseño experimental sobre concentraciones y tiempos de incubación fue igual al ya descrito para los monosacáridos. Las incubaciones también se realizaron en un medio de Krebs-Ringer-Henseleit carente de azúcares, y los parámetros evaluados fueron los mismos que en la primera fase de este trabajo. Además, en este caso se determinó el comportamiento cinético de la actividad lactato deshidrogenasa (LDH) como punto clave de control de la entrada de substratos hacia el ciclo de Krebs. Este estudió estableció la presencia de un tipo de LDH específico de esperma en el espermatozoide de cerdo, lo que fue evidenciado a través del análisis del Western blot y confirmado por los resultados de inmunocitoquímica, los cuales mostraron una reacción positiva en la pieza principal de la cola, con una débil señal en la pieza intermedia.La conclusión principal que se pudo deducir de los resultados obtenidos con los substratos no glucolisables fue que los espermatozoides de cerdo pueden utilizar eficientemente como única fuente de energía tanto el citrato como el lactato, la utilización de estos sustratos se lleva a cabo a través de vías energéticas controladas por la LDH, es decir, básicamente el ciclo de Krebs, siendo el ritmo de flujo asimismo estrechamente regulado por los niveles intracelulares de ATP.También se evaluó en este caso el efecto de la incubación con citrato o lactato sobre el patrón de fosforilación en residuos de tirosina. En este caso, al incubar con 10 mM de citrato o lactato se observó un aumento notable de la intensidad de todas las bandas, especialmente de la de 45Kda, si bien no aparecían cambios significativos en el patrón de bandas específico de fosforilación, este resultado indica igualmente una falta de acción específica de los sustratos sobre la funcionalidad espermática.El objetivo final de nuestro trabajo fue el diseño de cuatro fórmulas experimentales, que combinaran un monosacárido a diferentes concentraciones con un sustrato no glucolisable (citrato o lactato a diferentes concentraciones), con el objetivo primordial de estudiar el efecto que tiene estos cambios en el tipo específico de suministro energético en la conservación a largo plazo en refrigeración. La finalidad subyacente a este estudio fue la de obtener información para la obtención de un diluyente de conservación de semen refrigerado porcino que lograra sobrepasar los 7 días de conservación entre 15 y 17ºC. Para evaluar la eficacia de estas cuatro formulas en la conservación de semen refrigerado de cerdo se midieron los siguientes parámetros: Los porcentajes de viabilidad y de acrosomas alterados, como indicadores del estado funcional del espermatozoide, el ritmo de formación de lactato, los Tests de Resistencia Osmótica (ORT) y de Resistencia Hiperosmótica (HRT), como las pruebas de mayor significación para evaluar la calidad de los espermatozoides, tal y como ha sido descrito en publicaciones previas. La conclusión final fue que un medio que contenga niveles altos de glucosa (siempre inferiores a los que contienen los diluyentes comerciales más ampliamente utilizados) y niveles relativamente bajos de lactato como fuente alternativa de energía permite una conservación de los espermatozoides porcinos a temperaturas entre 15-17ºC por un tiempo mayor a lo observado incluso en diluyentes comerciales utilizados ampliamente, como el BTS. Por lo tanto, un diseño optimizado de las fuentes energéticas glucolíticas y no glucolíticas es imprescindible para la mejora de los diluyentes de semen porcino en refrigeración. / The first objective study was to determine the mechanisms of energy use of different monosaccharides the (glucose, fructose, mannose y sorbitol), on the part of the pig sperms. For it, the sperms were incubated without any energy substrate and with different hexoses. The used concentrations of the hexoses were of 10 mM, whenever it was wanted to determine the effect of the time of incubation, and of 1 mM, 5 mM, 10 mM, 20 mM, and 50 mM when what was sought to determine was the effect of the concentration of the substrate metabolically. The incubations were carried out during 5 minutes, 15 minutes, 30 minutes and 60 minutes, for the case of the effect time, and during 60 minutes to analyze the effect concentration. The incubations were carried out in means of lacking Krebs-Ringer-Henseleit of energy substrata. After these incubations, as much the viability as the state of the acrosomes like functional markers of the sperms was determined. The levels intracellular of some energy metabolites were also determined, as the glucose 6-phophate, the glycogen and ATP. Also, the rhythm of formation of L-lactate extra cellular coming from the glycolysis was also measured and that of CO2 as final product of the cycle of Krebs. The extracted more excellent conclusion of this study was that the glucose is the monosaccharide used preferably by the pig sperms.As complementation of the previous study, the kinetic behaviour of the main enzymatic activities was also studied that they control the route glycolytic, like they are the hexokinase, and piruvato kinase. Finally, the phosphorilation pattern of tyrosine was also evaluated in residuals sperms of pig. The cellular extracts showed a uniform pattern, with a band of majority phosphorilation to 45 Kda of weight. This pattern did not suffer significant changes after the incubation with anyone of the sugars.Another of the objectives consisted on evaluating the use of substrates non glycolitics, and therefore, not usable through the glycolysis, for the energy obtaining like the citrate and the lactate n the part of the pig sperms. The experimental design about concentrations and times of incubation already went similar to the described for the monosaccharide. The incubations were also carried out in a means of lacking Krebs-Ringer-Henseleit of sugars, and the evaluated parameters were the same ones that in the first phase of this work. Also, in this case the kinetic behaviour of the activity lactate deshidrogenasa was determined as key point of control of the entrance of substrata toward the cycle of Krebs. This studied it established the presence of a type of specific LDH of sperm in the pig sperm, what was evidenced through the analysis of the Western blot and confirmed by the immunocytochemistry results, which showed a positive reaction in the main piece of the line, with a weak sing in the intermediate piece.The main conclusion that one could deduce from the results obtained with the substrata non glycolizables was that the pig sperms can use efficiently as only energy source as much the citrate as the lactate, the use of these substrates is carried out through energy roads controlled by the LDH, that is to say, basically the cycle of Krebs, being also the rhythm of flow closely regulated by the levels intracellular of ATP.It was also evaluated in this case the effect of the incubation with citrate or lactate on the phosphorilitation pattern in tyrosine residuals. In this case, when incubating with 10 mM of citrate or lactate a remarkable increase of the intensity of all the bands it was observed, especially of that of 45 Kda, although significant changes did not appear in the specific band in pattern of phosphorilation, this results indicates a lack of specific action of the substrates equally about the spermatic functionality.The final objective of our work was the design of four experimental formulas that combined a monosaccharide to different concentrations with a substrate non glycolizable (citrate or lactate to different concentrations), with the primordial objective of studying the effect that has these changes in the specific type of energy supply in the long term conservation in refrigeration. The underlying purpose to this study was the one of obtaining information for the obtaining of a diluter of conservation of swinish refrigerated semen that was able to surpass the 7 days of conservation between 15 and 17ºC. To evaluate the effectiveness of four experimental formulas in the conservation of refrigerated semen of pig the following parameters they were measured: The percentages of viability and of altered acrosomes, as indicators of the functional state of the sperm, the rhythm of lactate formation, the Tests of Osmotic Resistance (ORT) y Tests of Resistance Hiperosmotic (HRT). The final conclusion was that a means that contains high levels of glucose (always inferior to those that contain the broadly used commercial diluters) y even relatively low of lactate like alternative source of energy allows a conservation from the swinish sperms to temperatures among 15-17ºC for a while bigger to that even observed in commercial diluters used thoroughly. Therefore, an optimized design of the sources energy glucolityc and non glucolityc are indispensable for the improvement of the diluters of swinish semen in refrigeration.
| Identifer | oai:union.ndltd.org:TDX_UAB/oai:www.tdx.cat:10803/5669 |
| Date | 21 June 2005 |
| Creators | Medrano Díaz, Antonio Arvelo |
| Contributors | Rodríguez Gil, Joan Enric, Universitat Autònoma de Barcelona. Departament de Ciència Animal i dels Aliments |
| Publisher | Universitat Autònoma de Barcelona |
| Source Sets | Universitat Autònoma de Barcelona |
| Language | Spanish |
| Detected Language | Spanish |
| Type | info:eu-repo/semantics/doctoralThesis, info:eu-repo/semantics/publishedVersion |
| Format | application/pdf |
| Source | TDX (Tesis Doctorals en Xarxa) |
| Rights | info:eu-repo/semantics/openAccess, ADVERTIMENT. L'accés als continguts d'aquesta tesi doctoral i la seva utilització ha de respectar els drets de la persona autora. Pot ser utilitzada per a consulta o estudi personal, així com en activitats o materials d'investigació i docència en els termes establerts a l'art. 32 del Text Refós de la Llei de Propietat Intel·lectual (RDL 1/1996). Per altres utilitzacions es requereix l'autorització prèvia i expressa de la persona autora. En qualsevol cas, en la utilització dels seus continguts caldrà indicar de forma clara el nom i cognoms de la persona autora i el títol de la tesi doctoral. No s'autoritza la seva reproducció o altres formes d'explotació efectuades amb finalitats de lucre ni la seva comunicació pública des d'un lloc aliè al servei TDX. Tampoc s'autoritza la presentació del seu contingut en una finestra o marc aliè a TDX (framing). Aquesta reserva de drets afecta tant als continguts de la tesi com als seus resums i índexs. |
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