As moscas-das-frutas são consideras pragas da fruticultura mundial, sendo que a espécie de maior importância econômica na região Neotropical é Anastrepha fraterculus. Sabe-se que na verdade A. fraterculus corresponde a um complexo de espécies crípticas; vários estudos têm se focado na caracterização destas espécies e no desenvolvimento de estratégias de controle populacional. Trabalhos anteriores mostraram que o silenciamento de genes envolvidos na determinação sexual de Anastrepha, como o transformer-2, constitui uma potencial ferramenta que pode ser usada em programas com este propósito, por gerar uma maior proporção de machos, uma vez que a proteína Transformer-2 funcional é necessária para o desenvolvimento do fenótipo feminino. Na ausência desta proteína um embrião XX se desenvolve com o fenótipo masculino (pseudomacho). Esse tipo de abordagem pode ser utilizado para otimizar a produção de moscas em biofábricas. Nesses estudos prévios o dsRNA foi injetado diretamente em ovos, o que constitui uma técnica de execução bastante complexa e que resulta em uma alta mortalidade durante o processo, inviabilizando sua utilização em um contexto aplicado. Aqui nós descrevemos os efeitos do silenciamento gênico de transformer-2 a partir da injeção parental de dsRNA em A. sp.1 affinis fraterculus, com o intuito de verificar se ocorre o silenciamento gênico na progênie. Para isso, fêmeas adultas foram injetadas com transformer-2 dsRNA em seu abdome e cruzadas com machos não tratados. Suas progênies foram coletadas ao longo de cinco semanas e analisadas quanto a (a) proporção sexual, (b) presença de pseudomachos (XX), (c) fertilidade dos machos e (d) morfologia sexual, além de análises de (e) emergência e de (f) assimetria de estruturas dos adultos, que são indicadores relevantes para a aplicação dessa técnica. A análise da proporção sexual mostrou um desvio significativo da proporção esperada de 1?:1? a favor dos machos, sendo o máximo desvio detectado entre as semanas 1 e 3 após a injeção. A análise dos cariótipos revelou a presença de pseudomachos (XX) na progênie. A maioria dos adultos apresentou morfologia das estruturas sexuais normal, exceto um pequeno número de indivíduos, que tinham gônadas assimétricas. Os testes de fertilidade revelaram que todos os machos apresentaram espermatozoides móveis em seus testículos, mas algumas fêmeas, referentes aos cruzamentos estéreis, não tinham espermatozoides em suas espermatecas. As análises de emergência dos adultos e assimetria de asas e mostraram que não há diferenças em relação ao controle, mas há aumento da assimetria de cerdas frontais da cabeça. Esses resultados indicam que alguns indivíduos da progênie de fêmeas injetadas com transformer-2 dsRNA foram afetados pelo silenciamento gênico de transformer-2. Além disso, as análises de morfologia e assimetria sugerem que esse tratamento causa perturbações no desenvolvimento desses organismos. Finalmente, os testes de fertilidade mostraram que alguns machos da progênie são funcionalmente estéreis, por serem incapazes de transferir espermatozoides para as fêmeas, possivelmente os pseudomachos (XX). A produção de uma progênie com maior número de machos a partir da interferência na expressão de um único gene pode ser bastante útil para melhorar o manejo da produção de machos em biofábricas / Fruit flies are worldwide fruticulture pest, and the economic important species in Neotropics is Anastrepha fraterculus. It is known that actually A. fraterculus corresponds to a cryptic species complex; many studies have focused in characterizing those species and development of population control strategies. Previous studies showed that silencing genes involved in sex determination of Anastrepha, such as transformer-2, are potential tools to be used in control programs that require male production in a large scale. The Transformer-2 protein is required to development of female phenotype. In the absence of this protein, an XX embryo develops in male phenotype (pseudomale). In previous studies, dsRNA was injected directly in embryos, which consists in a high complex executing technique with high rates of mortality during this process, difficulting your utility in an applied context. Herein we describe the effects of transformer-2 gene silencing by parental injection of dsRNA in A. sp.1 affinis fraterculus, to verify whether gene silencing occurs in progeny. For that, adult females were injected with transformer-2 dsRNA in its abdomen and crossed to non-treated males. Their progeny were recovered by five weeks and analysed by (a) sex ratio, (b) presence of pseudomales (XX), (c) fertility of males and (d) sexual morphology, besides analysis of (e) emergence and (f) asymmetry of wings and head setae, what consists in indicators of goodness of progeny. Sex ratio analysis showed a significant bias of expected 1:1, in favour of males, significant between weeks 1 and 3. Karyotype analysis revealed presence of pseudomales (XX) in progeny. The most of flies exhibited sexual structures morphology normal, except by a few individuals having asymmetric testes. Fertility tests showed that all males had motile spermatozoids in their testes, but some females, regarding to sterile crosses, had no spermatozoids in their spermathecae. Emergence and wing asymmetry analysis showed that there is no significant differences in relation to control, but there is a significant increase in asymmetry of head setae. The results indicate that the progeny from females treated with transformer-2 dsRNA were affected by transformer-2 gene silencing. Besides, the morphological analysis suggest that the treatment has a low impact in disturbing ontogeny of the progeny comparing to method of injection directly in eggs. Finally, fertility tests showed that some males of progeny are functionally sterile, unable to transfer spermatozoids to females, possibly the pseudomales ones (XX). The production of a male enriched progeny by interference in expression of a single gene could be very useful to improve the management of male production in biofabrics
| Identifer | oai:union.ndltd.org:usp.br/oai:teses.usp.br:tde-20102016-164736 |
| Date | 23 June 2016 |
| Creators | Vento, Pietro Enrico Vicari |
| Contributors | Scheepmaker, Denise Selivon |
| Publisher | Biblioteca Digitais de Teses e Dissertações da USP |
| Source Sets | Universidade de São Paulo |
| Language | Portuguese |
| Detected Language | Portuguese |
| Type | Dissertação de Mestrado |
| Format | application/pdf |
| Rights | Liberar o conteúdo para acesso público. |
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