L’adaptateur Lnk est un inhibiteur clé dans le système hématopoïétique. Son invalidation chez la souris entraîne l’hyperprolifération des lignages myéloïdes (mégacaryocytaire et érythoïde). Les cellules Lnk présentent une hypersensibilité à certaines cytokines dont la Trombopoïétine (TPO) et l’Erythropoïétine (EPO) et la dérégulation de leurs voies de signalisation (JAK/STAT et MAPK). D’autre part, le phénotype Lnk s’assimile aux caractéristiques trouvées chez les patients atteints des syndromes myéloprolifératifs (SMPs), suggérant un rôle clé de Lnk dans ces maladies. L’identification récente des mutations de LNK dans ces hémopathies l’a confirmé. Ainsi, l’objectif de mon travail de thèse était de définir les mécanismes moléculaires par lesquels Lnk régule la mégacaryopoïèse en disséquant son interaction avec son partenaire, la kinase JAK2, dans la voie TPO/Mpl. En parallèle, nous avons visé à déterminer le rôle de Lnk dans la pathogénèse de SMPs. Afin d’étudier le rôle de Lnk dans les SMPs, nous avons effectué une analyse transcriptionnelle de Lnk dans les cellules CD34 et les plaquettes de patients exprimant JAK2WT ou JAK2V617F. Nos résultats ont montré uns surexpression de Lnk, dans les témoins sains. Cette surexpression est due à l’induction de l’expression de Lnk par la TPO, montrant une boucle de rétrorégulation par Lnk de la voieTPO/Mpl/JAK2. Par ailleurs l’analyse de l’interaction Lnk/JAK2 dans les plaquettes des patients atteints de SMPs a démontré que Lnk est capable de s’associer à JAK2 (JAK2WT et JAK2V617F) E outre cette liaison est indépendante de la stimulation par la TPO et abouti à une phosphorylation constitutive de Lnk.Notre analyse au niveau moléculaire de l’interaction Lnk/JALK2 a révélé, qu’en plus du domaine SH2 de Lnk, la région N-terminale et le domaine PH de Lnk ont un nouveau rôle important dans l’inhibition de la kinase JAK2. Nous avons également montré une association entre Lnk et les formes mutées dans les SMPs, JAK2V617F ou JAK2K539L avec une infimité plus élevée qu’avec JAK2WT, suggérant ainsi une régulation différentielle de ces formes par Lnk. L’analyse fonctionnelle de ces formes par Lnk. L’analyse fonctionnelle par des essais de prolifération cellulaire, a montré que Lnk, inhibe la croissance de cellules exprimant JAK2V617F et ceci de manière dos-dépendante. Nous avons ensuite entrepris l’étude des effets des mutations de LNK (LNKG152R et LNKE208Q) identifiées dans les SMPs. Nos résultats ont indiqué que seule la mutation LNKE208Q semble affecter la localisation membranaire de l’adaptateur. De plus nous avons montré que cette mutation de LNK altère son effet inhibiteur sur la croissance cellulaire dépendante de JAK2, contrairement à la mutation de LNKG152R ayant elle-même un effet modéré. Ces résultats montrent que ces mutations de LNK affectent différemment les réponses cellulaires dépendantes de JAK2 dans les SMPs. Ainsi, nos données suggèrent que la région N-terminale et le domaine PH de LNK sont importants pour moduler sa fonction inhibitrice sur JAK2. L’ensemble de nos travaux nous a permis une meilleure caractérisation de la régulation de la kinase JAK2, par Lnk dans la voie de le TPO. Ainsi, une déstabilisation du complexe Lnk/JAK2 affecte la fonction inhibitrice de l’adaptateur, ce qui peut contribuer au développement de désordres hématopoïétiques. L’interaction différentielle entre Lnk et les formes JAK2WT ou mutées suggère la possibilité d’utiliser Lnk comme outil thérapeutique innovant dans les SMPs, et éventuellement dans les autres hémopathies. / The Lnk adaptor is a key inhibitor of cytokine signaling during hematopoiesis. Lnk mice show abnormal magakaryopoiesis due to loss of Lnk inhibition of thrombopoietin (TPO)-mediated JAK2/STAT and MAPK activation. The ressemblance between Lnk phenotype and Myeloproliterative Neoplasms (MPNs) features together with the identification of LNK mutations in MPNs patients suggest a role for Lnk in these diseases. We aimed to characterize the functional role of Lnk in regulating magakaryopoiesis and also define its role in MPN pathogenesis. Transcriptional analysis of Lnk in MPN cells (expressing JAK2WT and mutated form JAK2V617F) showed its overexpression, notably in JAK2V617F-positive patients. This increase in Lnk level is partly due to its up-regulation by TPO. Studies on TPO-simulated MPN Platelets revealed the interaction between Lnk and JAK2 and the subsequent Lnk phosphorylation. Our molecular analysis showed that Lnk/JAK2 binding occurs via Lnk SH2 domain and revealed a new role for its N-terminal and PH doamins in the regulation of the kinase. We also showed that Lnk binds more strongly to JAK2V617F and JAK2K539L, mutated in MPNs, that with JAK2WT, suggesting that the adaptor regulates differently the JAK2 forms. Moreover, the overexpression of Lnk in JAK2V617F celles showed a dose dependent growth inhibition.Furthermore, our analysis of the LNK mutations found in MPNs, G152R in N-terminal and E208Q PH domains showed that only the E208Q mutation affect Lnk subcellular localization. Moreover, we demonstrated that these mutations, and mostly E208Q, alter the inhibitory function of Lnk on cell growth in JAK2V617F- expressing cells. Altogether, our results show that Lnk is involved in the regulatory loop TPO/Mpl receptor/JAK2 essential in magakaryopoiesis. Thus, changes in Lnk expression and its JAK2 binding can contribute to the developement of MPNs. The differential binding of Lnk with JAK2WT and mutated forms suggests a potential therapeutic use of the adaptor in the MPNs.
| Identifer | oai:union.ndltd.org:theses.fr/2014PA132003 |
| Date | 14 March 2014 |
| Creators | Magdoud, Hajer |
| Contributors | Paris 13, Velazquez, Laura |
| Source Sets | Dépôt national des thèses électroniques françaises |
| Language | French |
| Detected Language | French |
| Type | Electronic Thesis or Dissertation, Text |
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