A manutenção da infecção latente pelo M. tuberculosis (TBIL) pode ser atribuída à sua capacidade de sobreviver durante anos no organismo humano em um estado não replicativo (dormente). A proteína HspX do M. tuberculosis, induzida sob condições de hipóxia, está fortemente associada com a manutenção da viabilidade do bacilo na TBIL. O presente estudo tem como objetivo, verificar se a superexpressão da proteína HspX altera a expressão de genes envolvidos com a síntese de componentes da parede celular, replicação do DNA e divisão celular de bacilos, assim como, na expressão de genes envolvidos com a resposta imune inata em macrófagos infectados com esses bacilos. O gene hspX foi amplificado pela PCR a partir do DNA do M. tuberculosis H37Rv, clonado no vetor de expressão pFPCA1GFP, e a proteína HspX expressa em M. smegmatis mc2155. As bactérias, nas quais, a presença da proteína recombinante foi confirmada por Western Blot, foram utilizadas, para a análise de expressão gênica tanto em bactérias quanto em macrófagos infectados. O estudo de expressão gênica foi realizado utilizando a RT-qPCR. Quando comparado aos controles, as bactérias que expressavam a proteína HspX apresentaram uma redução na expressão de genes de replicação do DNA e divisão celular, que foi acompanhado por uma tendência a filamentação das células e uma redução no tamanho das colônias. Além disso, nos macrófagos infectados com a bactéria expressando a proteína HspX, houve um aumento tanto da expressão do mRNA quanto da secreção de IL-1b, citocina importante para estabilização do granuloma, e uma redução na expressão de IRGM, gene relacionado com o processo autofágico, importante mecanismo de defesa do hospedeiro contra bactérias intracelulares. Portanto, em conjunto, essas alterações de expressão gênica, em consequência da presença da proteína HspX sugerem uma contribuição, direta ou indireta, dessa proteína para a adaptação morfológica e metabólica da bactéria dormente durante a TBIL, e consequentemente, para a resposta imune inata dos macrófagos infectados favorecendo a viabilidade intracelular dessas bactérias. / The maintenance of Mycobacterium tuberculosis infection latent (TBIL) may be attributed to its ability to persist for years in the host in a non-replicative state (dormant). The HspX protein from M. tuberculosis, induced under hypoxic, is strongly associated with maintaining the bacillus viability in TBIL. This study aims to determine if HspX overexpression chances the expression of genes involved in the synthesis of cell wall components, DNA replication and cell division of bacilli, as well as, the expression of genes involved in innate immune response of macrophages infected. The gene hspX was amplified by PCR from DNA of M. tuberculosis H37Rv, and cloned into the expression vector pFPCA1GFP. The HspX was expressed in M. smegmatis mc2155 and the recombinant protein was confirmed by Western blot. The bacterias expressing HspX were used for gene expression analysis both in bacteria and in infected macrophages by RT-PCRq. In bacterias expressing HspX, it was observed a reduction in expression of genes involved in DNA replication and cell division, and with cells more filamentous and smaller colonies, compared with controls. In addition, in macrophages infected with bacillus expressing HspX, there was an increase in both mRNA expression and secretion of IL-1b, an important cytokine for granuloma stability, and a reduction in expression of IRGM, an autophagic gene, important for host defense mechanism against intracellular bacteria. Together, these results suggest a direct or indirect contribution of HspX protein for metabolic and morphological adaptation of dormant bacteria in TBIL, and for the innate immune response in infected macrophages, improving the bacteria intracellular viability.
| Identifer | oai:union.ndltd.org:usp.br/oai:teses.usp.br:tde-25042013-152531 |
| Date | 22 March 2013 |
| Creators | Bastos, Gisele Medeiros |
| Contributors | Hirata, Mario Hiroyuki |
| Publisher | Biblioteca Digitais de Teses e Dissertações da USP |
| Source Sets | Universidade de São Paulo |
| Language | Portuguese |
| Detected Language | Portuguese |
| Type | Tese de Doutorado |
| Format | application/pdf |
| Rights | Liberar o conteúdo para acesso público. |
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