Einleitung: Kardiovaskuläre Erkrankungen stellen weltweit die häufigste Todesursache dar. Bis heute gibt es keine ursächliche Therapie für die Herzinsuffizienz, die die gemeinsame Endstrecke einer Vielzahl von unterschiedlichen kardialen Erkrankungen bildet. Auch die Gentherapie hat in der Kardiologie, anders als in anderen Bereichen, noch keinen großen Fortschritt erzielen können. Das Kalziumsensorprotein S100A1 stellt aber einen vielversprechenden Kandidaten für die kardiale Gentherapie dar, da es als zentraler Regulator der Herzfunktion und des Kalziumsignalwegs innerhalb der Kardiomyozyten identifiziert werden konnte.
Ziele der Untersuchungen: Diese translationale Studie sollte dazu beitragen, dem Ziel einer kardialen Gentherapie der kardialen Dysfunktion einen Schritt näher zu kommen. Zum einen sollte hierzu ein auf adeno-assoziierten Viren (AAVs) basierender Vektor (rAAV) des Serotyps 5 in Verbindung mit einem kardiospezifischen Promotor (CMVenh/0,26 kb-MLC) auf seine Anwendbarkeit und Sicherheit für die kardiale Gentherapie untersucht werden. Durch eine umfangreiche Testung auf präexistierende neutralisierende Serumfaktoren (NSF) sollte zudem untersucht werden, ob das Schwein generell ein geeignetes Modelltier für AAV5-basierte präklinische Studien darstellt. Zum anderen sollte in einem endpunktbasierten Studiendesign der Effekt der hS100A1-Gentherapie nach Myokardinfarkt (MI) im humanrelevanten Großtiermodell weiter charakterisiert werden.
Tiere, Material und Methoden: Insgesamt wurden 83 juvenile Schweine aus einem kommerziellen Herkunftsbetrieb verwendet. Vor Versuchsbeginn wurde das Serum von 40 Tieren mittels eines auf Durchflusszytometrie basierenden Zellreporter-Assays auf präexistierende NSF gegen AAV5 untersucht. Für die Hauptstudie wurde bei 8 Tieren eine 2 stündige perkutane Okklusion des Ramus circumflexus der linken Koronararterie (LCX) durchgeführt und so ein ischämischer Myokardinfarkt mit anschließender Reperfusion und resultierender kardialer Dysfunktion induziert. Nach 2 Wochen wurden Infarktgröße und Herzfunktion mittels Kardio-Magnetresonanztomographie (MRT) evaluiert. Die Tiere wurden in die Therapiegruppe (AAV5-hS100A1, 5 Tiere) oder Kontrollgruppe (AAV5-hRluc, 3 Tiere) aufgeteilt. Der Gentransfer (1x1013 virale Genomkopien (vgc)/Tier)) erfolgte per retrograder koronarvenöser Infusion. 12 Wochen nach Gentransfer wurde eine erneute Kardio-MRT Untersuchung durchgeführt. Zur Überprüfung der pharmakologischen Sicherheit wurden während des Versuchs serielle Blut und Elektrokardiogramm (EKG) Untersuchungen durchgeführt. Am Versuchsende wurden die Tiere schmerzfrei getötet und ihre Organe für weitere molekularbiologische Untersuchungen entnommen. Zur Untersuchung der Verteilung und Transkriptionseffizienz der vgc wurde aus den Gewebeproben DNA und RNA isoliert und anschließend eine quantitative Echtzeit-Polymerase-Kettenreaktion (qPCR) durchgeführt. Zusätzlich erfolgte eine Next-Generation Sequenzierung der myokardialen RNA, die mit einer gewichteten Gen Co-Expressionsanalyse (WGCNA) und anschließender Anreicherungsanalyse untersucht wurde. Zur Reduktion der Tierzahl wurde die Studie Endpunkt orientiert durchgeführt: sobald die beiden Gruppen signifikant unterschiedliche Ergebnisse in den Endpunkten (EF und Infarktausweitung) erzielten, wurde die Studie beendet.
Ergebnisse: Die Ergebnisse zeigen eine niedrige anti-AAV5-Seroprävalenz in der Hausschweinpopulation. Die AAV5-hS100A1-Gentherapie führte nach 12 Wochen zu einer signifikanten Verringerung der Infarktausweitung und zu einer signifikant höheren EF im Vergleich zur Kontrollgruppe (ungepaarter zweiseitiger Student t-Test, p < 0,05). Die EKG- und Blutuntersuchungen ergaben keine Hinweise auf Toxizität. Die Transkriptomanalyse der Myokardproben lieferte mit der EF und Infarktausweitung signifikant und stark negativ korrelierende pathophysiologisch relevante Signalwege. Dabei scheint u.a. eine antiinflammatorische Wirkung von AAV5-hS100A1 von großer Bedeutung zu sein. Erstmals konnte auch eine Interaktion zwischen S100A1 und der kardioprotektiven Retinsäure gezeigt werden. In einer aufgrund der hohen Mortalität während der MI-Induktion eingeschobene Versuchsreihe mit 72 Tieren konnte durch den Wechsel des Narkosegases von Isofluran auf Sevofluran die Mortalität signifikant gesenkt werden (einseitiger Fisher’s exact test, p < 0,05).
Schlussfolgerungen: Das Schwein stellt ein geeignetes Modelltier für AAV5-basierte Versuchsvorhaben dar. Das zu testende Konstrukt AAV5-hS100A1 mit CMVenh/0,26 kb-MLC Promotor zeigte bei einer hohen pharmakologischen Sicherheit eine robuste und weitestgehend kardiospezifische Expression des Transgens 12 Wochen nach Gentransfer. Es verfügt somit über ein großes therapeutisches Potenzial. Die Studie konnte dazu beigetragen, neue Signalwege zu identifizieren, die für den Wirkmechanismus von S100A1 relevant sein könnten. Durch die Änderung des Narkosegases konnte die Mortalität bei der MI-Induktion gesenkt werden. In zukünftigen MI-Studien sollte daher die Aufrechterhaltung der Inhalationsanästhesie bevorzugt mittels Sevofluran erfolgen.:Inhaltsverzeichnis
Abkürzungsverzeichnis
1 Einleitung
2 Literaturübersicht
2.1 Koronare Herzkrankheit, Myokardinfarkt und Herzinsuffizienz
2.1.1 Definition und Epidemiologie
2.1.2 Infarktheilung
2.1.3 Therapiemöglichkeiten
2.2 (Kardiale) Gentherapie
2.2.1 Vektoren
2.2.1.1 AAV5
2.2.2 Promotoren
2.2.3 Applikationsmethoden
2.3 S100A1 als therapeutisches Protein in der kardialen Gentherapie
2.3.1 Die Struktur von S100A1
2.3.2 Die Funktion von S100A1
2.3.3 Die kardiale S100A1-Gentherapie
2.4 Das Schwein in der translationalen Forschung
3 Material und Methoden
3.1 Material für die Aufarbeitung der Proben im Labor
3.1.1 Geräte und Verbrauchsmaterialien
3.1.2 Reagenzien und Chemikalien
3.1.3 Kits
3.1.4 Medien und Puffer
3.2 Material für den Großtier-OP und das Kardio-MRT
3.2.1 Geräte
3.2.2 Katheter und Schleusen
3.2.3 Medikamente und Medizinprodukte
3.3 Allgemeiner Versuchsaufbau
3.3.1 Versuchstiere
3.3.2 Versuchsaufbau
3.3.3 Vorbereitung, Narkose, perioperative Überwachung und Versorgung
3.3.4 Blutentnahme
3.3.5 Gefäßzugänge
3.3.6 Induktion des Myokardinfarkts
3.3.6.1 Änderung der Narkoseaufrechterhaltung während der MI-Induktion
3.3.7 Kardio-MRT – Durchführung
3.3.8 Gentransfer
3.3.9 Virale Vektoren
3.3.10 Organentnahme
3.4 Untersuchung auf neutralisierende Antikörper und Serumfaktoren
3.5 Bestimmung der Genexpression mittels qPCR
3.5.1 Homogenisierung und RNA-/DNA-Isolierung
3.5.2 cDNA-Synthese
3.5.3 Primer und Probes
3.5.4 qPCR im multiplex-Ansatz
3.5.5 Quantifizierung der Vektorgenomkopien mittels SYBR-qPCR
3.6 Kardio-MRT – Auswertung
3.7 Transkriptomanalyse
3.7.1 Next-Generation RNA-Sequenzierung – Durchführung
3.7.2 NGS – Auswertung
3.7.3 Hauptkomponentenanalyse
3.7.4 Gewichtete Gen Korrelation Netzwerk Analyse
3.7.5 Anreicherungsanalyse
3.8 Blutanalyse
3.9 Elektrokardiogramm – Auswertung
3.10 Statistische Auswertung
4 Ergebnisse
4.1 Erfüllung der Einschlusskriterien zur Aufnahme in die Studie
4.1.1 Seroprävalenz von neutralisierenden Antikörpern und Serumfaktoren gegen AAV5
4.1.2 Infarktgröße vor Gentherapie
4.2 Mortalität beim perkutanen LCX-Ischämie-/Reperfusionsmodell
4.3 Gentransfer
4.3.1 Überprüfung der Spezifität der Primer und Probes
4.3.2 Distribution der viralen Vektoren im linken Ventrikel
4.3.3 Transgenexpression im linken Ventrikel
4.3.4 Trankriptionseffizienz im linken Ventrikel
4.3.5 Systemische Verteilung
4.4 Einfluss der hS100A1-Gentherapie auf die kontraktile Funktion und Infarktgrößenentwicklung nach Myokardinfarkt
4.4.1 Effekte auf die Ejektionsfraktion
4.4.2 Effekte auf die Infarktausweitung
4.4.3 Ergebnisse der Transkriptomanalyse
4.5 Einfluss der hS100A1-Gentherapie auf die pharmakologische Sicherheit
4.5.1 Blutanalyse
4.5.2 Elektrokardiogramm
5 Diskussion
5.1 Eignung des Tiermodells
5.1.1 Seroprävalenz von neutralisierenden Antikörpern und Serumfaktoren in der Versuchstierart Schwein
5.1.2 Das perkutane LCX-Ischämie-/Reperfusionsmodell als experimentelles Modell zur Untersuchung der Infarktausweitung
5.1.3 Einfluss des Narkosegases auf die Mortalitätsrate beim perkutanen LCX-Ischämie-/ Reperfusionsmodell
5.2 Eignung des Vektorkonstruktes für die kardiale Gentherapie
5.2.1 Kardiale und systemische Biodistribution, Expression und Transkriptionseffizienz
5.2.2 Pharmakologische Sicherheit der AAV5-hS100A1-Gentherapie
5.2.2.1 Blutanalyse
5.2.2.2 Elektrokardiogramm
5.3 Effekte der hS100A1-Gentherapie
5.3.1 Einfluss auf die Ejektionsfraktion
5.3.2 Einfluss auf die Infarktausweitung
5.4 Limitationen des Studiendesigns und des tierexperimentellen Modells
5.5 Fazit und Ausblick
6 Zusammenfassung
7 Summary
8 Literaturverzeichnis
9 Anhang
10 Danksagung / Introduction: Cardiovascular diseases are the prevailing cause of death worldwide. To date, there is no causal therapy for heart failure, which represents the common endpoint of a large number of different cardiac diseases. Even the promising gene therapy approach has not yet been able to achieve relevant progress in this field. Identified as a central regulator of cardiac activity and calcium signaling in cardiomyocytes, the calcium-sensor protein S100A1 represents a highly suitable candidate for cardiac gene therapy.
Objective: The overall goal of this translational study is to advance the field of gene therapy for cardiac dysfunction. On the one hand, the on adeno-associated viruses (AAVs) based vector (rAAV) of serotype 5 was tested in combination with a cardiac-specific promotor (cmvenh/0,26 kb-mlc) for its applicability and safety for cardiac gene therapy. Beforehand, extensive testing for preexisting neutralizing serum factors (nsf) was performed to decipher whether the pig is a suitable model for AAV5-based preclinical studies. On the other hand, the effect of the hS100A1 gene therapy after myocardial infarction (MI) was further characterized in a clinically relevant large animal model with an endpoint-based study design.
Animals, materials and methods: A total of 83 juvenile farm pigs were used. Before starting the experiment, we analyzed serum from 40 animals for preexisting nsf against AAV5 using a flow cytometry-based cell reporter assay. For the main study, we used 8 animals in which we induced an ischemic myocardial infarction with subsequent reperfusion by occluding percutaneously the ramus circumflexus of the left coronary artery (LCX) for 2 hours to generate cardiac dysfunction. After 2 weeks, we evaluated infarct size and cardiac function with cardiac magnetic resonance imaging (MRI). Animals were divided into the treatment group (AAV5-hS100A1, 5 animals) and the control group (AAV5-hRluc, 3 animals). We applied gene transfer (1x1013 viral genome copies (vgc)/animal) using retrograde coronary venous infusion. We repeated the cardiac MRI 12 weeks after gene transfer. Serial blood and electrocardiogram (ECG) tests were performed during the experiment to verify pharmacological safety. At the end of the study, the animals were euthanized and their organs were collected for further molecular analyses. To investigate the distribution and transcriptional efficiency of the vectors, we isolated DNA and RNA from the tissue samples and performed real-time quantitative polymerase chain reaction (qPCR). In addition, a next-generation sequencing of myocardial RNA was conducted and analyzed with weighted gene co-expression network analysis (WGCNA) and subsequent enrichment analysis. To reduce the number of animals, the study was end point oriented: When reaching significant differences in the primary end points (ejection fraction (EF) and infarct extension), the study was terminated.
Results: The results demonstrate a low anti-AAV5 seroprevalence in the farm pig population. After 12 weeks, the AAV5-hS100A1 gene therapy resulted in a significant reduction of infarct extension and a significantly higher EF compared to the control group (unpaired two-sided Student t-Test, p < 0.05). ECG and blood tests did not show any indications of toxicity. The transcriptome analysis of the myocardial samples provided a significant negative correlation between relevant pathological signaling pathways and EF/infarct extension, thus giving clues to underlying mechanisms. Among these, an anti-inflammatory effect of AAV5-hS100A1 appears to be of major importance. For the first time, we could also demonstrate an interaction between S100A1 and the cardioprotective retinoic acid. Due to the high mortality during MI-induction, we incorporated a test series with 72 animals. By changing the anesthetic gas from isoflurane to sevoflurane, we could significantly reduce the mortality (one-sided Fisher's exact test, p < 0.05).
Conclusions: The pig represents a suitable model for AAV5-based studies. 12 weeks after gene transfer, the construct AAV5-hS100A1 with cmvenh/0.26 kb-mlc promoter showed a robust and mostly cardiospecific expression of the transgene accompanied by high pharmacological safety. Thus, it provides great therapeutical potential. The study contributed to identify novel signaling pathways that may be relevant for S100A1’s therapeutic actions. By changing the anesthetic gas, we could reduce the mortality during infarct induction. Therefore, in future MI studies, sevoflurane should be used preferably to maintain inhalation anesthesia.:Inhaltsverzeichnis
Abkürzungsverzeichnis
1 Einleitung
2 Literaturübersicht
2.1 Koronare Herzkrankheit, Myokardinfarkt und Herzinsuffizienz
2.1.1 Definition und Epidemiologie
2.1.2 Infarktheilung
2.1.3 Therapiemöglichkeiten
2.2 (Kardiale) Gentherapie
2.2.1 Vektoren
2.2.1.1 AAV5
2.2.2 Promotoren
2.2.3 Applikationsmethoden
2.3 S100A1 als therapeutisches Protein in der kardialen Gentherapie
2.3.1 Die Struktur von S100A1
2.3.2 Die Funktion von S100A1
2.3.3 Die kardiale S100A1-Gentherapie
2.4 Das Schwein in der translationalen Forschung
3 Material und Methoden
3.1 Material für die Aufarbeitung der Proben im Labor
3.1.1 Geräte und Verbrauchsmaterialien
3.1.2 Reagenzien und Chemikalien
3.1.3 Kits
3.1.4 Medien und Puffer
3.2 Material für den Großtier-OP und das Kardio-MRT
3.2.1 Geräte
3.2.2 Katheter und Schleusen
3.2.3 Medikamente und Medizinprodukte
3.3 Allgemeiner Versuchsaufbau
3.3.1 Versuchstiere
3.3.2 Versuchsaufbau
3.3.3 Vorbereitung, Narkose, perioperative Überwachung und Versorgung
3.3.4 Blutentnahme
3.3.5 Gefäßzugänge
3.3.6 Induktion des Myokardinfarkts
3.3.6.1 Änderung der Narkoseaufrechterhaltung während der MI-Induktion
3.3.7 Kardio-MRT – Durchführung
3.3.8 Gentransfer
3.3.9 Virale Vektoren
3.3.10 Organentnahme
3.4 Untersuchung auf neutralisierende Antikörper und Serumfaktoren
3.5 Bestimmung der Genexpression mittels qPCR
3.5.1 Homogenisierung und RNA-/DNA-Isolierung
3.5.2 cDNA-Synthese
3.5.3 Primer und Probes
3.5.4 qPCR im multiplex-Ansatz
3.5.5 Quantifizierung der Vektorgenomkopien mittels SYBR-qPCR
3.6 Kardio-MRT – Auswertung
3.7 Transkriptomanalyse
3.7.1 Next-Generation RNA-Sequenzierung – Durchführung
3.7.2 NGS – Auswertung
3.7.3 Hauptkomponentenanalyse
3.7.4 Gewichtete Gen Korrelation Netzwerk Analyse
3.7.5 Anreicherungsanalyse
3.8 Blutanalyse
3.9 Elektrokardiogramm – Auswertung
3.10 Statistische Auswertung
4 Ergebnisse
4.1 Erfüllung der Einschlusskriterien zur Aufnahme in die Studie
4.1.1 Seroprävalenz von neutralisierenden Antikörpern und Serumfaktoren gegen AAV5
4.1.2 Infarktgröße vor Gentherapie
4.2 Mortalität beim perkutanen LCX-Ischämie-/Reperfusionsmodell
4.3 Gentransfer
4.3.1 Überprüfung der Spezifität der Primer und Probes
4.3.2 Distribution der viralen Vektoren im linken Ventrikel
4.3.3 Transgenexpression im linken Ventrikel
4.3.4 Trankriptionseffizienz im linken Ventrikel
4.3.5 Systemische Verteilung
4.4 Einfluss der hS100A1-Gentherapie auf die kontraktile Funktion und Infarktgrößenentwicklung nach Myokardinfarkt
4.4.1 Effekte auf die Ejektionsfraktion
4.4.2 Effekte auf die Infarktausweitung
4.4.3 Ergebnisse der Transkriptomanalyse
4.5 Einfluss der hS100A1-Gentherapie auf die pharmakologische Sicherheit
4.5.1 Blutanalyse
4.5.2 Elektrokardiogramm
5 Diskussion
5.1 Eignung des Tiermodells
5.1.1 Seroprävalenz von neutralisierenden Antikörpern und Serumfaktoren in der Versuchstierart Schwein
5.1.2 Das perkutane LCX-Ischämie-/Reperfusionsmodell als experimentelles Modell zur Untersuchung der Infarktausweitung
5.1.3 Einfluss des Narkosegases auf die Mortalitätsrate beim perkutanen LCX-Ischämie-/ Reperfusionsmodell
5.2 Eignung des Vektorkonstruktes für die kardiale Gentherapie
5.2.1 Kardiale und systemische Biodistribution, Expression und Transkriptionseffizienz
5.2.2 Pharmakologische Sicherheit der AAV5-hS100A1-Gentherapie
5.2.2.1 Blutanalyse
5.2.2.2 Elektrokardiogramm
5.3 Effekte der hS100A1-Gentherapie
5.3.1 Einfluss auf die Ejektionsfraktion
5.3.2 Einfluss auf die Infarktausweitung
5.4 Limitationen des Studiendesigns und des tierexperimentellen Modells
5.5 Fazit und Ausblick
6 Zusammenfassung
7 Summary
8 Literaturverzeichnis
9 Anhang
10 Danksagung
| Identifer | oai:union.ndltd.org:DRESDEN/oai:qucosa:de:qucosa:85613 |
| Date | 30 May 2023 |
| Creators | Kehr, Dorothea Christine |
| Contributors | Universität Leipzig |
| Source Sets | Hochschulschriftenserver (HSSS) der SLUB Dresden |
| Language | German, English |
| Detected Language | German |
| Type | info:eu-repo/semantics/publishedVersion, doc-type:doctoralThesis, info:eu-repo/semantics/doctoralThesis, doc-type:Text |
| Rights | info:eu-repo/semantics/openAccess |
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