A prolactina humana (hPRL) é um hormônio polipeptídico secretado pela hipófise anterior sob regulação do hipotálamo, envolvido em uma variedade de processos biológicos como o desenvolvimento da glândula mamária e lactação. O produto recombinante é importante no diagnóstico médico e no tratamento de insuficiência da lactação. Este hormônio pode ocorrer sob a forma de proteína não glicosilada (NG-hPRL) e glicosilada (G-hPRL), com pesos moleculares de aproximadamente 23 e 25 kilodalton (kDa), respectivamente; possui um único sítio de N-glicosilação localizado na asparagina (Asn) posição 31, que é parcialmente ocupado, representando assim um modelo particularmente interessante de glicosilação. A atividade biológica da G-hPRL é muito menor comparada à NG-hPRL (~4 vezes) e sua função fisiológica ainda não é bem definida: a porção de carboidrato parece ter um importante papel na biossíntese, secreção, atividade biológica, e sobrevivência plasmática do hormônio. O objetivo principal desse trabalho foi comparar as estruturas dos N-glicanos presentes na prolactina glicosilada hipofisária (G-hPRL-NHPP) com a recombinante. Para obter a G-hPRL recombinante foi realizada uma produção em escala laboratorial a partir de células de ovário de hamster chinês (CHO) geneticamente modificadas e adaptadas ao crescimento em suspensão. Foi adicionada, ao meio de cultura cicloheximida (CHX), cujo efeito principal foi aumentar a relação G-hPRL/NGhPRL que passou de 5% para 38%, facilitando assim a purificação da G-hPRL. A G-hPRL foi purificada em duas etapas, uma troca catiônica seguida de purificação por cromatografia liquida de alta eficiência de fase reversa (RP-HPLC) que se demonstrou eficiente na separação das duas isoformas de hPRL. A G-hPRL recombinante IPEN foi assim analisada por diversas técnicas confirmando a sua pureza e atividade biológica, incluindo comparações com outras amostras de referências de origem hipofisária adquirida junto ao National Hormone & Peptide Program (NHPP-E.U.A.) . Foi realizada também a determinação inédita de Nglicanos presentes na G-hPRL produzida por células CHO e na G-hPRL nativa, produzida pela hipófise humana, possibilitando comparar as duas estruturas de carboidratos e alcançando assim uma das principais metas desse projeto. Entre as principais diferenças encontradas nas estruturas dos dois N-glicanos, destacam-se a baixa quantidade de ácido siálico (NeuAc), a alta porcentagem de glicanos sulfatos (74,0%) e com fucose (Fuc) (93,3%) presentes na amostra hipofisária e a tendência da preparação recombinante de apresentar glicanos com maior peso molecular e com uma menor variação nas isoformas. / Human prolactin (hPRL) is a polypeptide hormone secreted by the anterior pituitary under the regulation of the hypothalamus, involved in a variety of biological processes such as mammary gland development and lactation. The recombinant product is important in medical diagnosis and treatment of failure of lactation. This hormone may occur in the form of non-glycosylated protein (NGhPRL) and glycosylated (G-hPRL) with molecular weights of approximately 23 and 25 kilodalton (kDa), respectively; has a single N-glycosylation site located at asparagine (Asn) position 31, which is partially occupied, thus being a particularly interesting model of glycosylation. The biological activity of G-hPRL is lower compared to NG-hPRL (~4 times) and its physiological function is not well defined: the portion of carbohydrate appears to have an important role in the hormone biosynthesis, secretion, biological activity, and plasma survival of the hormone. The main objective of this study was to compare the structures of N-glycans present in glycosylated pituitary prolactin (G-hPRL-NHPP) with those present in the recombinant. To obtain the recombinant G-hPRL the production was performed in laboratory scale from Chinese hamster ovary cells (CHO), genetically modified and adapted to growth in suspension. Cycloheximide (CHX), whose main effect was to increase the ratio G-hPRL/NG-hPRL from 5% to 38% was added to the culture medium, thereby facilitating the purification of G-hPRL. The G-hPRL was purified in two steps, a cation exchanger followed by a purification by reversed-phase high performance liquid chromatography (RP-HPLC) which demonstrated the efficient separation of the two isoforms of hPRL. Recombinant G-hPRL-IPEN was well characterized by several techniques confirming its purity and biological activity, including comparisons with other reference preparation of pituitary origin purchased from the \"National Hormone & Peptide Program (NHPPU. S.)\". The composition of N-glycans present in the G-hPRL, produced by CHO cells, and that of native G-hPRL, produced by the human pituitary gland, were also determined for the first time, allowing the two structures of carbohydrates to be compared and thus, achieving one of the main goals of this project. Among the main differences in N-glycan structures, we highlight the low presence of sialic acid (NeuAc) and the high percentage of sulfated glycans (74.0%) and of fucose (Fuc) (93.3%) in the pituitary sample and the tendency of the recombinant preparation to present glycans with higher molecular weight and less isoforms variation.
| Identifer | oai:union.ndltd.org:usp.br/oai:teses.usp.br:tde-04072013-161538 |
| Date | 26 April 2013 |
| Creators | Capone, Marcos Vinicius Nucci |
| Contributors | Soares, Carlos Roberto Jorge |
| Publisher | Biblioteca Digitais de Teses e Dissertações da USP |
| Source Sets | Universidade de São Paulo |
| Language | Portuguese |
| Detected Language | English |
| Type | Dissertação de Mestrado |
| Format | application/pdf |
| Rights | Liberar o conteúdo para acesso público. |
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