Introdução: A 3-hidroxi-3-metilglutaril coenzima A redutase (HMGCR) é a enzima limitante da via do mevalonato. Esta via, que tem como produto final o colesterol, gera inúmeros subprodutos, como os isoprenóides, essenciais para modificação pós-traducional de várias proteínas envolvidas em proliferação e crescimento celular. Em tecidos esteroidogênicos (por exemplo, córtex adrenal), a HMGCR pode desempenhar um papel tanto no controle do crescimento e proliferação celular quanto na esteroidogênese. HMGCR está hiperexpressa em várias formas de neoplasias humanas inclusive em tumores adrenocorticais (ACTs), mas a sua importância na biologia dos ACTS é desconhecida. Objetivos: Avaliar o padrão de expressão da HMGCR e outros genes que participam na economia de colesterol e esteroidogênese em ACTs adultos e pediátricos; avaliar o efeito do inibidor da HMGCR lovastatina na via proliferativa MAPK; e analisar os efeitos de vários inibidores da via mevalonato na viabilidade de células NCI-H295A. Casuística e métodos: Analisamos a expressão do RNAm por PCR em tempo real dos genes HMCGR, FDFT1, SCARB1, LDLR StAR, TSPO, CYP11A1, CYP11B1, CYP17A1, CYP21A1 e HSD3B1, em ACTs, incluindo 27 tumores de adultos: [17 adenomas (ACA) e 10 carcinomas (ACC)]; 21 tumores de crianças [13 adenomas (PAD) e 8 carcinomas (PAC)]. Um pool comercial de RNA poli A obtido de córtex adrenal normal humano foi utilizado como amostra referência. A fosforilação da proteína ERK 1/2 (efetor final da via MAPK) no extrato intracelular de células NCI-H295A após tratamento com lovastatina foi avaliada através de SDS-PAGE seguido por immunoblot com anticorpos específicos. A ação sob a viabilidade celular em células NCI-H295A dos inibidores da via mevalonato foi realizada por análise colorimétrica. Resultados: A maioria dos ACTs de adultos apresentou expressão diminuída de StAR, TSPO, CYP11A1, CYP11B1, CYP17A1, CYP21A1 e HSD3B1 e hiperexpressão da HMGCR. Neste grupo, a expressão relativa dos genes StAR, TSPO, CYP11B1, CYP21A1 e HSD3B1 foi significativamente menor nos ACCs (p <0,02). O gene LDLR não foi diferencialmente expresso na maioria dos ACTs do grupo adulto, enquanto que o gene SCARB1 e FDFT1 estavam hipoexpressos nestes tumores, independentemente do comportamento biológico. A análise de grupamento mostrou que ACCs formam um grupo distinto dos ACAs, com exceção de uma amostra. Com relação aos tumores do grupo pediátrico, não houve diferença na expressão dos genes estudados entre PAD e PAC. A expressão de HMGCR e TSPO se correlacionou inversamente, enquanto uma significativa correlação positiva entre StAR, CYP11A1, CYP11B1, CYP17A1, CYP21A1 e HSD3B1 foi observada nos ACTs do grupo adulto. O tratamento de células NCI-H295A com lovastatina provocou uma diminuição na fosforilação ERK 1/2. A inibição da HMGCR e isoprenilação de proteínas diminuiu drasticamente a viabilidade das células NCI-H295A, ao contrário do bloqueio específico da síntese de colesterol, que não apresentou efeito sobre a viabilidade celular. Conclusão: A hipoexpressão de genes relacionados à esteroidogênese e, em menor grau, a hiperexpressão da HMGCR caracterizam os ACCs. A hiperexpressão da HMGCR leva a um aumento na isoprenilação de proteínas e não da produção de colesterol, pois os principais genes envolvidos na esteroidogênese estão hipoexpressos e o bloqueio específico da síntese de colesterol não interferiu na viabilidade das células NCI-H295A. A isoprenilação de proteínas (por exemplo, Ras) é um evento crucial para viabilidade das células NCI-H295A e está envolvida na ativação de cascatas de sinalização de proliferação celular. A via mevalonato é um alvo potencial para o tratamento dos tumores adrenocorticais / Introduction: 3-hydroxy-3-methylglutaryl coenzime A reductase (HMGCR) is the rate-limiting enzyme of the mevalonate pathway, which generates isoprenoids for both post-translational modification of several proteins involved in cell growth and proliferation and biosynthesis of cholesterol. Therefore, in steroidogenic tissues (e. g. adrenal cortex), HMGCR may play a role in both growth control and steroidogenesis. HMGCR is overexpressed in several forms of human neoplasms incluiding adrenocortical tumors (ACTs), but its importance in the biology of ACTs is unknown. Objective: To assess the expression pattern of HMGCR, and other genes involved in cholesterol economy and steroidogenesis in pediatric and adult ACTs. To evaluate the impact of a HMGCR inhibitor lovastatin on proliferative pathway- MAPK - of NCI-H295A cells; to evaluate the effects of various mevalonate pathway inhibitors in NCI-H295A cells viability. Methods: We analyzed HMGCR, FDFT1, LDLR, SCARB1, StAR, TSPO, CYP11A1, CYP11B1, CYP17A1, CYP21A1 and HSD3B1 mRNA expression by real-time RT-PCR in ACTs [Adult tumors: 14 adenomas (ACA) and 11 carcinomas (ACC); Pediatric tumors: 13 adenomas (PAD) and 8 carcinomas (PAC)]. A commercial pool of normal human adrenal cortex poly A RNA was used as reference sample. We assess ERK phosphorylation after treatment with lovastatin through SDS-PAGE of intracellular extract followed by immunoblotting with specific antibodies. Action of mevalonate pathway inhibitors on cellular viability was assessed by colorimetric assay. Results: Most adult ACTs showed decreased expression of StAR, TSPO, CYP11A1, CYP11B1, CYP17A1, CYP21A1 and HSD3B1 and overexpression of HMGCR. In this group, the relative expressions of TSPO, StAR, CYP11B1, CYP21A1 and HSD3B1 were significantly lower in the ACCs (P<0.02). LDLR was not differentially expressed in most of adults ACTs, while FDFT1 and SCARB1 were hypoexpressed in this group, independently of biological behavior. Cluster analysis showed that adult ACCs form a group distinct from adrenocortical adenomas, with exception of one carcinoma sample. Regarding tumors of the pediatric group, no differences in the expression of evaluated genes were found between PAD and PAC. The expression of HMGCR and TSPO correlated negatively while a significantly positive pairwise correlation among StAR, CYP11A1, CYP11B1, CYP17A1, CYP21A1 e HSD3B1 was observed in adults ACTs. Lovastatin treatment leads a decreased ERK phosphorylation in NCI-H295A cells. Inhibition of HMGCR, farnesyl syntase and protein isoprenylation decreased drastically NCI-H295A viability unlike the specific block of cholesterol biosyntheses that did not have any effect on cell viability. Conclusion: The hypoexpression of genes related to steroidogenesis and (to a lesser degree) the overexpression of HMGCR characterizes ACCs. HMGCR overexpression cause an increased isoprenylation of proteins rather than cholesterol production for steroidogenesis or membrane cellular integrity since the key regulators involved in this process were downregulated and specific inhibition of cholesterol did not affect NCI-H295A viability. Isoprenylation of proteins is a crucial event for NCI-H295A viability and is involved in signaling cascades (e.g. Ras). Mevalonate pathway is a potential target for treatment of adrenocortical tumors
| Identifer | oai:union.ndltd.org:usp.br/oai:teses.usp.br:tde-18022011-122810 |
| Date | 04 February 2011 |
| Creators | Valassi, Helena Panteliou Lima |
| Contributors | Lin, Chin Jia |
| Publisher | Biblioteca Digitais de Teses e Dissertações da USP |
| Source Sets | Universidade de São Paulo |
| Language | Portuguese |
| Detected Language | Portuguese |
| Type | Tese de Doutorado |
| Format | application/pdf |
| Rights | Liberar o conteúdo para acesso público. |
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