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Previous issue date: 2013-03-04 / Coordena??o de Aperfei?oamento de Pessoal de N?vel Superior / Recently, genetically encoded optical indicators have emerged as noninvasive tools of
high spatial and temporal resolution utilized to monitor the activity of individual neurons and
specific neuronal populations. The increasing number of new optogenetic indicators, together
with the absence of comparisons under identical conditions, has generated difficulty in
choosing the most appropriate protein, depending on the experimental design. Therefore, the
purpose of our study was to compare three recently developed reporter proteins: the calcium
indicators GCaMP3 and R-GECO1, and the voltage indicator VSFP butterfly1.2. These
probes were expressed in hippocampal neurons in culture, which were subjected to patchclamp
recordings and optical imaging. The three groups (each one expressing a protein)
exhibited similar values of membrane potential (in mV, GCaMP3: -56 ?8.0, R-GECO1: -57
?2.5; VSFP: -60 ?3.9, p = 0.86); however, the group of neurons expressing VSFP showed a
lower average of input resistance than the other groups (in Mohms, GCaMP3: 161 ?18.3;
GECO1-R: 128 ?15.3; VSFP: 94 ?14.0, p = 0.02). Each neuron was submitted to current
injections at different frequencies (10 Hz, 5 Hz, 3 Hz, 1.5 Hz, and 0.7 Hz) and their
fluorescence responses were recorded in time. In our study, only 26.7% (4/15) of the neurons
expressing VSFP showed detectable fluorescence signal in response to action potentials
(APs). The average signal-to-noise ratio (SNR) obtained in response to five spikes (at 10 Hz)
was small (1.3 ? 0.21), however the rapid kinetics of the VSFP allowed discrimination of
APs as individual peaks, with detection of 53% of the evoked APs. Frequencies below 5 Hz
and subthreshold signals were undetectable due to high noise. On the other hand, calcium
indicators showed the greatest change in fluorescence following the same protocol (five APs
at 10 Hz). Among the GCaMP3 expressing neurons, 80% (8/10) exhibited signal, with an
average SNR value of 21 ?6.69 (soma), while for the R-GECO1 neurons, 50% (2/4) of the
neurons had signal, with a mean SNR value of 52 ?19.7 (soma). For protocols at 10 Hz, 54%
of the evoked APs were detected with GCaMP3 and 85% with R-GECO1. APs were
detectable in all the analyzed frequencies and fluorescence signals were detected from
subthreshold depolarizations as well. Because GCaMP3 is the most likely to yield
fluorescence signal and with high SNR, some experiments were performed only with this
probe. We demonstrate that GCaMP3 is effective in detecting synaptic inputs (involving Ca2+
influx), with high spatial and temporal resolution. Differences were also observed between
the SNR values resulting from evoked APs, compared to spontaneous APs. In recordings of
groups of cells, GCaMP3 showed clear discrimination between activated and silent cells, and
reveals itself as a potential tool in studies of neuronal synchronization. Thus, our results
indicate that the presently available calcium indicators allow detailed studies on neuronal
communication, ranging from individual dendritic spines to the investigation of events of
synchrony in neuronal networks genetically defined. In contrast, studies employing VSFPs
represent a promising technology for monitoring neural activity and, although still to be
improved, they may become more appropriate than calcium indicators, since neurons work
on a time scale faster than events of calcium may foresee / Neur?nios se comunicam por meio de sinapses, trocando mensagens capazes de modificar o
potencial de membrana de outros neur?nios. Demonstrar o papel desses sinais e decodificar
essa linguagem el?trica representa o grande objetivo da neuroci?ncia moderna. Atualmente, a
eletrofisiologia ? o ramo da neuroci?ncia capaz de investigar esses recursos el?tricos de
neur?nios - que v?o desde registros de condut?ncia e comportamento cin?tico de canais
i?nicos individuais at? a demonstra??o de neur?nios individuais implicados em
comportamentos complexos. Nesse sentido, diferentes estados cerebrais e comportamentos
implicam o recrutamento de grandes conjuntos de neur?nios se comunicando em um estado
coerente, din?mico. Al?m disso, essas grandes popula??es s?o formadas por diversos
subtipos neuronais cuja an?lise requer t?nicas que possibilitem uma resolu??o temporal e
espacial de c?lulas individuais e, prefencialmente, de subtipos espec?ficos. Apenas
recentemente, indicadores ?pticos geneticamente codificados surgiram como ferramentas n?o
invasivas de alta resolu??o espacial e temporal utilizados para monitorar a atividade de
neur?nios individuais e popula??es neuronais espec?ficas. O n?mero crescente de novos
indicadores optogen?ticos, juntamente com a aus?ncia de compara??es em condi??es
id?nticas, gerou dificuldade em escolher a mais adequada das prote?nas, dependendo do
desenho experimental. Portanto, o objetivo deste estudo foi comparar tr?s prote?nas rep?rter
recentemente desenvolvidas: os indicadores de c?lcio GCaMP3 e R-GECO1, e o indicador de
voltagem VSFP butterfly1.2. Foram expressos em neur?nios do hipocampo em cultura, os
quais foram submetidos a registros de patch-clamp e de imageamento ?ptico. Os tr?s grupos
(cada um expressando uma prote?na) exibiram valores semelhantes de potencial de membrana
(em mV, GCaMP3: -56 ? 8,0; R-GECO1: -57 ? 2,5; VSFP: -60 ? 3,9; p = 0,86), no entanto,
o grupo de neur?nios que expressam VSFP mostrou uma m?dia mais baixa de resist?ncia de
entrada do que os outros grupos (em Mohms, GCaMP3: 161 ? 18,3; GECO1-R: 128 ? 15,3;
VSFP: 94 ? 14,0; p = 0,02). Cada neur?nio foi submetido a inje??es de correntes com
frequ?ncias diferentes (10 Hz, 5 Hz, 3 Hz, 1,5 Hz, e 0,7 Hz) e as suas respostas de
fluoresc?ncia foram registradas. Em nosso estudo, apenas 26,7% (4/15) dos neur?nios que
expressam VSFP mostraram sinal de fluoresc?ncia detect?vel em resposta a potenciais de
a??o. O valor m?dio de sinal-para-ru?do (SNR), obtido em resposta a cinco potenciais de aҫ?o
(a 10 Hz) foi pequeno (1,3 ? 0,21), no entanto a cin?tica r?pida do VSFP permite a
discrimina??o de disparos, como picos individuais, com detec??o de 53% dos APs evocados.
Freq??ncias abaixo de 5 Hz, assim como variaҫ?es no potencial de membrana subliminares,
foram indetect?veis devido ao alto ru?do do sinal de fluoresc?ncia. Por outro lado, os
indicadores de c?lcio mostraram maior altera??o na fluoresc?ncia, seguindo o mesmo
protocolo (cinco potenciais de aҫ?o a 10 Hz). Entre os neur?nios expressando GCaMP3, 80%
(8/10) exibiram sinal, com um valor m?dio de SNR de 21 ? 6,69 (soma), enquanto que para
os neur?nios expressando R-GECO1, 50% (2/4) dos neur?nios demonstraram sinal com um
valor m?dio SNR de 52 ? 19,7 (soma). Para protocolos de 10 Hz, 54% dos disparos foram
detectados com evocado GCaMP3 e 85% com o R-GECO1. Disparos foram detectados em
todas as frequ?ncias e os sinais de fluoresc?ncia foram tamb?m detectados a partir de
despolariza??es subliminares. Sendo GCaMP3 o indicador mais prov?vel de produzir sinal de
fluoresc?ncia e com alto SNR, alguns experimentos foram realizados somente com essa
prote?na. Observamos que GCaMP3 ? eficaz na detec??o de inputs sin?pticas (envolvendo
influxo de Ca2+), com alta resolu??o espacial e temporal. Tamb?m foram observadas
diferen?as entre os valores de SNR resultantes dos disparos evocados, em compara??o com
os disparos espont?neos. Em registros de grupos de c?lulas, GCaMP3 mostrou clara
discrimina??o entre c?lulas ativadas e sil?ncio, revelando-se como uma ferramenta potencial
em estudos de sincroniza??o neuronal. Assim, nossos resultados sugerem que os indicadores
de c?lcio dispon?veis atualmente permitem estudos detalhados sobre a comunica??o neuronal,
que v?o desde dendritos individuais at? a investiga??o de eventos de sincronia em redes
neuronais geneticamente definidas. Em contraste, VSFPs representam uma tecnologia
promissora para monitorar a atividade neural e, apesar de ainda requererem melhoramentos,
podem se tornar mais apropriados do que os indicadores de c?lcio, uma vez que os neur?nios
trabalham em uma escala de tempo mais r?pida do que eventos de c?lcio podem prever
| Identifer | oai:union.ndltd.org:IBICT/oai:repositorio.ufrn.br:123456789/17026 |
| Date | 04 March 2013 |
| Creators | Vieira, Hermany Munguba |
| Contributors | CPF:99944251615, http://lattes.cnpq.br/0683942077872227, Le?o, Emelie Katarina Svahn, CPF:01771638605, http://lattes.cnpq.br/1279823352935722, Amaral, Olavo Bohrer, CPF:95668128091, http://lattes.cnpq.br/4987439782337345, Le?o, Richardson Naves |
| Publisher | Universidade Federal do Rio Grande do Norte, Programa de P?s-Gradua??o em Neurociencias, UFRN, BR, Neurobiologia Celular e Molecular; Neurobiologia de Sistemas e Cogni??o; Neurocomputa??o Neuroengen |
| Source Sets | IBICT Brazilian ETDs |
| Language | Portuguese |
| Detected Language | English |
| Type | info:eu-repo/semantics/publishedVersion, info:eu-repo/semantics/masterThesis |
| Format | application/pdf |
| Source | reponame:Repositório Institucional da UFRN, instname:Universidade Federal do Rio Grande do Norte, instacron:UFRN |
| Rights | info:eu-repo/semantics/openAccess |
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