O pistilo, contido na flor, contém diferentes tecidos especializados. O estudo da expressão gênica neste órgão é fundamental para um melhor entendimento do processo reprodutivo vegetal. Experimentos de RT-PCR, utilizando um \"pool\" de cDNAs de estigma/estilete de Nicotiana tabacum, permitiram a clonagem do cDNA MT1. Este transcrito codifica uma proteína com alta similaridade a metiltransferases da família SABATH, e corresponde à seqüência completa do gene NtJAMT (Nicotiana tabacum Jasmonic Acid Methyltransferase). Metiltransferases são enzimas capazes de transferir radicais metil, a partir de um substrato doador (SAM - S-adenosil-L-metionina), para grupamentos carboxílicos livres em diversos metabólitos secundários de plantas, tais como os ácidos salicílico, benzóico, jasmônico e dihidro jasmônico. Os compostos metilados resultantes estão envolvidos em processos fisiológicos cruciais para as plantas, como por exemplo, desenvolvimento do vegetal, polinização, respostas de defesa, e sinalização química, entre outros. Através da abordagem de MEFS, ensaios de captação de compostos voláteis usando flores de Nicotiana tabacum no estádio 11 do desenvolvimento floral, foram realizados. Análises por CG-EM mostraram que apenas os compostos MeJa e dihidroMeJa foram identificados, nos três períodos de amostragem (manhã , tarde e noite). Ensaios adicionais in vivo, utilizando pistilos inteiros macerados em solução saturada de CaCl2 5M, foram realizados. Após análises por MEFS/CG-EM, foi detectada a presença apenas do composto dihidroMeJa, e nenhum traço dos outros três compostos foi identificado. O cDNA MT1 foi clonado nos vetores pDEST17 e pETSUMO, resultando nas construções pEXP17-MT1 e pETSUMO-MT1 que produziram, respectivamente, as proteínas recombinantes rMT1 e rS-MT1. A proteína rMT1 foi utilizada em ensaios enzimáticos in vitro, na presença de diferentes substratos (ácidos salicílico/benzóico/jasmônico/dihidro jasmônico), em quantidades equimolares (10mM). Dois tipos de ensaios foram realizados: 1) os ácidos foram adicionados, separadamente, no meio de cultura bacteriano induzido, e também no lisado celular (ensaio individual); e 2) dois diferentes ácidos foram adicionados, em cada frasco, no meio de cultura bacteriano induzido (ensaio de competição). Análises por CG-EM mostraram que, nos ensaios individuais, a proteína rMT1 foi capaz de produzir o composto metiljasmonato (MeJa) predominantemente, tanto nos ensaios em meio de cultura, quanto nos ensaios utilizando o lisado celular, sendo que neste último obteve-se o melhor resultado. No ensaio em meio de cultura, o composto metilbenzoato (MeBa) foi obtido em baixa quantidade, o composto metilsalicilato (MeSa) foi produzido em uma quantidade extremamente baixa, e o composto dihidro metiljasmonato (dihidroMeJa) não foi detectado. Nos ensaios de competição enzimática, o composto MeJa foi o único a ser produzido, nos frascos onde o ácido jasmônico foi adicionado juntamente com outro ácido. A proteína rS-MT1, purificada em resina de níquel, foi capaz de produzir apenas os compostos MeJa e dihidroMeJa, como demonstrado pelas análises por CG-EM. Ensaios enzimáticos in vitro, utilizando as proteínas r46B11 e r134B02, correspondendo aos putativos transcritos de processamento alternativo do gene NtJAMT, foram realizados. Utilizando os mesmos ácidos como substratos, nas mesmas concentrações daquelas usadas para rMT1, mostrouse que r46B11 produziu MeJa predominantemente, MeSa e MeBa em quantidades extremamente baixas, e o dihidroMeJa não foi produzido. De acordo com os resultados de CG-EM, a proteína r134B02 foi capaz de produzir apenas o MeJa. Anticorpos policlonais, produzidos contra a proteína rMT1 em camundongos Balb/C, foram utilizados em ensaios de ELISA e western blot. O anticorpo anti-rMT1 foi capaz de reconhecer as três proteínas, rMT1, r46B11 r134B02, em ensaios de western blot, demonstrando alta imunoreatividade. Ensaios adicionais de ELISA e western blot, com proteínas totais extraídas dos tecidos do estigma/estilete, ovário e folha, e o anticorpo antirMT1 como anticorpo primário, foram capazes de demonstrar a presença de metiltransferases nos tecidos do estigma/estilete e ovário, que estão ausentes em folhas. Esses resultados corroboram os experimentos de northern blot previamente realizados (Ângelo, 2001). A proteína r134B02 foi também utilizada para a produção de anticorpos policlonais em camundongos Balb/C. Em ensaios de western blot, esses anticorpos foram capazes de reconhecer a proteína r134B02, demonstrando alta imunoreatividade. Proteínas totais extraídas dos tecidos do estigma/estilete, ovário e folha foram usadas em um novo ensaio de western blot, com o anticorpo anti-r134B02. O resultado mostrou que esse anticorpo foi capaz de reconhecer uma banda correspondente à proteína MT1 nativa nos tecidos do estigma/estilete e ovário, assim como proteínas adicionais com massas variando de 18kDa a 32kDa nos mesmos tecidos, mas não reconheceu uma banda correspondente a proteína 134B02 nativa. Análises adicionais, realizadas em nosso banco de dados TOBEST, utilizando o programa TBlastX identificaram os clones TOBS114G06, TOBS040E09, TOBS076D02, codificando proteínas com alta similaridade às enzimas lipoxigenase (LOX), allene oxide cyclase (AOC) e 12-oxophytodienoate reductase (12-OPR), respectivamente, cruciais para a biossíntese do ácido jasmônico. Nenhum clone com similaridade significativa à enzima AOS foi encontrado durante esta análise. Além disso, uma pesquisa adicional no TOBEST identificou o clone TOBC130F10, codificando uma proteína com alta similaridade a fosfolipases do tipo A2, que são enzimas fundamentais nos primeiros passos da via de biossíntese do JA. Tomados juntos, os resultados apresentados aqui sugerem a existência de uma via de biossíntese do ácido jasmônico específica do pistilo, voltada para a produção de compostos jasmonatos nas flores de N. tabacum. É sugerido que tais compostos, atuando em sua forma volátil, estariam envolvidos em mecanismos de comunicação entre pistilos e estames da mesma flor, flores diferentes da mesma planta, ou em uma comunicação entre plantas vizinhas. Tal comunicação permitiria um controle temporal de amadurecimento dos órgãos reprodutivos (sincronização), favorecendo um processo de fertilização bem-sucedido / The pistil, enclosed in the flower, contains different specialized tissues. The study of gene expression in this organ is crucial to a better understanding of plant reproductive process. RT-PCR experiments, using a Nicotiana tabacum stigma/style cDNA pool from allowed the cloning of the MT1 cDNA. This transcript encodes a protein with high similarity to methyltransferases of the SABATH family and corresponds to the full-length sequence of NtJAMT (Nicotiana tabacum Jasmonic Acid Methyltransferase) gene. Methyltransferases are enzymes capable of transferring methyl radicals, from a donor substrate (SAM - S-adenosyl-L-methionine), to free carboxylic groups in several plant secondary metabolites such as salicylic/benzoic/jasmonic/dihydrojasmonic acids. The resulting methylated compounds are involved in crucial physiological process to plants as, for example, plant development, pollination, defense responses, and chemical signaling, among others. Through SPME approach, assays of volatile compounds capture using Nicotiana tabacum flowers at stage 11 of floral development were performed. GC-MS analyses have shown that only MeJa and dihydroMeJa compounds were identified, in the three sampling periods (morning, afternoon and evening). Additional in vivo assays, using whole pistils ground in a 5M CaCl2 saturated solution were performed. After SPME/GC-MS, only the dihydroMeJa compound was detected and no trace of the other three compounds was identified. The MT1 cDNA was cloned in the pDEST17 and pETSUMO vectors resulting in the pEXP17-MT1 and pETSUMO-MT1 constructions, which ge) given produced, respectively, the rMT1 and rS-MT1 recombinant proteins. The rMT1 protein was used in in vitro enzymatic assays, in the presence of equimolar amounts (10mM) of the different substrates (salicylic/benzoic/jasmonic/dihydrojasmonic acids). Two different kinds of assays were performed: 1) the acids were added separately in each vial containing the induced bacterial culture medium and also in the cell lysate (individual assay); and 2) two different acids were added, in each vial, in the induced bacterial culture medium (competition assay). GC-MS analyses have shown tha in the individual assays the rMT1 protein was capable of producing the methyljasmonate compound (MeJa) predominantly, in the culture medium assay, as well as in the cell lysate, in which a better result was obtained. In the culture medium assay, the methylbenzoate (MeBa) compound was obtained in low amount, the methylsalicilate (MeSa) compound was produced in an extremely low amount, and the dihydro methyljasmonate (dihydroMeJa) was not detected. In the competition enzymatic assays, the MeJa was the only compound produced, in the flasks in which jasmonic acid was added along with another acid. The rS-MT1 protein, purified in niquel resin, was capable of producing only the MeJa and dihydroMeJa compounds, as demonstrated by the GC-MS analysis. In vitro enzymatic assays, using the r46B11 and r134B02 proteins, corresponding to the putative alternative spliced transcripts from NtJAMT gene, were performed. Using the same acids as substrates, in the same concentrations used for rMT1, it was shown that r46B11 produced MeJa predominantly, MeSa and MeBA in extremely low amounst and the dihydroMeJa was not produced. According the GC-MS results, the r134B02 protein was capable of producing only MeJa. Policlonal antibodies produced against the rMT1 protein in Balb/C mice were used in ELISA and western blot assays. The anti-rMT1 antibody was capable to recognize the three proteins, rMT1, r46B11 and r134B02, in the western blot assay, demonstrating a high immunoreactivity. Additional ELISA and western blot assays, with total protein extracts from stigma/style, ovary and leaf tissues using the antir-MT1 as primary antibody were, capable to demonstrate the presence of methyltransferases in the stigma/style tissues, which are absent in leaves. These results corroborate the northern blot experiments previously performed (Ângelo, 2001). The r134B02 protein was also used to produce polyclonal antibodies in Balb/C mice. In western blot assays, this polyclonal antibody was capable of recognizing the r134B02 protein, demonstrating high immunoreactivity. Total protein extracts from stigma/style, ovary and leaf were used in a new western blot assay, using the anti-r134B02 antibody. The result has shown that this antibody is capable to recognize a band corresponding to the native MT1 protein in stigma/style and ovary tissues, as well as additional proteins with masses ranging from 18kDa to 32kDa in the same tissues, but did not recognized a band corresponding to the native 134B02 protein. Additional analysis, performed in our TOBEST database, using the TBlastX program, identified the TOBS114G06, TOBS040E09, TOBS076D02 clones, encoding proteins with high similarity to lipoxygenase (LOX), allene oxide cyclase (AOC) and 12- oxophytodienoate reductase (12-OPR) enzymes, respectively, crucial to the jasmonic acid (JA) biosynthesis pathway. No clone with significant similarity to the AOS enzyme was found during this analysis. Moreover, an additional search in the TOBEST identified the TOBC130F10 clone, encoding a protein with high similarity to type A2 phospholipases, which are fundamental enzymes in the first steps of JA biosynthesis pathway. Taken together, the results presented here suggest the existence of a pistil-specific JA biosynthesis pathway, towards the production of jasmonates compounds in the N. tabacum flowers. It is suggested that such compounds, acting in their volatile form, would be involved in a communication mechanism between pistils and stamens of the same flower, different flowers of the same plant, or in a communication between neighboring plants. Such communication would enable a temporal control of the reproductive organs ripening (synchronization), favoring a successful fertilization process
| Identifer | oai:union.ndltd.org:usp.br/oai:teses.usp.br:tde-22012016-092724 |
| Date | 30 June 2010 |
| Creators | Avanci, Nilton César |
| Contributors | Goldman, Maria Helena de Souza |
| Publisher | Biblioteca Digitais de Teses e Dissertações da USP |
| Source Sets | Universidade de São Paulo |
| Language | Portuguese |
| Detected Language | Portuguese |
| Type | Tese de Doutorado |
| Format | application/pdf |
| Rights | Liberar o conteúdo para acesso público. |
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