O A. fumigatus é um fungo saprofítico e tornou-se um dos principais agente patogênico oportunista em pacientes imunossuprimidos. Estudos prévios em nosso laboratório foi demonstrado que em mitocôndrias de P. brasiliensis e de A. fumigatus, o NAD+ era capaz de induzir a formação de potencial de membrana mitocondrial, o qual podia ser dissipado por FCCP, sugerindo a presença de um transportador de NAD+/NADH, conforme havia sido descrito em S. cerevisiae. Através de ferramentas de bioinformática, foi identificado no Aspergillus Gene Database, uma sequência com 32% de identidade com o gene ndt1p de S. cerevisiae. A sequência de cDNA, contendo 1.194 pb foi obtida usando PCR-Overlaping e clonada em vetor pGEM®-T Easy. Em seguida, a sequência foi subclonada em vetor de expressão pET28-a(+) e expressa em E. coli BL21(DE3). A proteína recombinante foi purificada a partir dos corpos de inclusão e sua identidade confirmada por espectrometria de massas e por Western Blotting usando anticorpo anti-His-tag. A proteína recombinante foi utilizada para produção de anticorpo policlonal anti-Ndt1 em coelho. Para expressão em levedura, o cDNA do gene ndt1 de A. fumigatus foi subclonado em vetor pYES2 e as leveduras S. cerevisiae ?ndt1?ndt2 foram transformadas. Foi realizada a curva de crescimento e indução da expressão da proteína recombinante Ndt1, a presença da proteína foi detectada utilizando anticorpo policlonal anti-Ndt1 após 16 horas de expressão. Nesse período foi verificado que as leveduras estavam em fase de crescimento exponencial. A cepa duplo mutante apresenta uma taxa de crescimento menor quando comparada com a cepa expressando a proteína recombinante quando crescidas em meio fermentável. As mitocôndrias isoladas de ambas as cepas foram submetidas à medida do potencial de membrana onde apresentavam acoplamento entre a oxidação de substratos e a fosforilação oxidativa. Além disso, ficou evidenciado que na cepa expressando a proteína recombinante, NAD+ induziu a formação de um potencial de membrana maior que na cepa controle. O transporte de NAD+ foi realizado e demonstrou que a cepa expressando a proteína Ndt1 tinha um aumento na fluorescência de NADH, mostrando que NAD+ foi capaz de entrar na matriz mitocondrial e posteriormente ser reduzido a NADH por enzimas da matriz mitocondrial. A determinação da produção de espécies reativas de oxigênio foi realizada utilizando as sondas fluorescentes CM-H2DCFDA e MitoSox Red em esferoplastos da levedura S. cerevisiae. Ambos experimentos não houve diferença significativa entre a cepa expressando a proteína Ndt1 e a cepa controle. As proteínas carboniladas foram determinadas utilizando anticorpo anti-DNP, após a reação com dinitrofenilhidrazona e não há diferença significativa entre as cepas. Finalmente, para confirmação da localização celular da proteína Ndt1, os esferoplastos de S. cerevisiae foram submetidos à microscopia confocal, onde ficou evidenciado a co-localização da proteína Ndt1 com as mitocôndrias na cepa de S. cerevisiae transformada com a construção pYES/ndt1, o mesmo perfil não foi observado na cepa ?ndt1?ndt2. / The A. fumigatus is a saprophytic fungus and is a major opportunistic pathogen in immunosuppressed patients. Previous studies in our lab has showed that mitochondrias of the P. brasiliensis and A. fumigatus, NAD+ is able to induce the formation of mitochondrial membrane potential, which could be dissipated by FCCP, suggesting the presence of a NAD+/NADH carrier as described in S. cerevisiae. Using bioinformatics tools, it was identified in Aspergillus Gene database a sequence containing 32% of identity with the gene ndt1p of S. cerevisiae. A fragment of cDNA was obtained from the ndt1p mRNA sequence, containing 1194 bp by using PCR-overlaping and cloned in pGEM®-T Easy vector. Then, the sequence was subcloned in pET28-a(+) vector and expressed in E. coli BL21 (DE3). The recombinant protein was purified from inclusion bodies and the identity confirmed by mass spectrometry and by Western Blotting using anti-His-tag antibody. The recombinant protein was used to produce polyclonal antibody anti-Ndt1 in rabbit. For expression in yeast, the ndt1 cDNA of A. fumigatus was subcloned into pYES2 vector and the yeast S. cerevisiae ?ndt1?ndt2 were transformed. Growth curve and induction of the recombinant protein expression Ndt1 was performed and the protein was detected using a polyclonal anti-Ndt1 antibody after 16 hours of expression. During this period it was found that the yeast were in exponential growth phase. The double mutant strain shows a slower growth rate compared to the strain expressing the recombinant protein growth rate when grown in fermentable medium. The isolated mitochondria from both strains were subjected to measurement of the membrane potential which showed coupling between substrate oxidation and oxidative phosphorylation. Furthermore, these measurements evidenced that the strain expressing the recombinant protein NAD+ induced the formation of a membrane potential larger than the control strain. The transport NAD+ was evaluated and showed that the strain expressing the protein Ndt1 has an increase in NADH fluorescence, indicating that NAD+ was able to enter into the mitochondrial matrix and then reduced to NADH by enzymes from the matrix. The determination of the production of reactive oxygen species was performed using the fluorescent probe CM-H2DCFDA and MitoSox Red in spheroplasts of the yeast S. cerevisiae. Both experiments showed no significant difference between the strain expressing Ndt1 protein and strain control. The carbonylated proteins levels were checked using anti-DNP, after the reaction with dinitrophenylhydrazone and there is no significant difference between the strains. Finally, to confirm the cellular localization of the protein Ndt1, spheroplasts of S. cerevisiae were subjected to confocal microscopy, which evidenced the co-location of Ndt1 protein with mitochondria in S. cerevisiae strain transformed with the construction pYES/ndt1. This same profile was not observed in strain ?ndt1?ndt2.
| Identifer | oai:union.ndltd.org:usp.br/oai:teses.usp.br:tde-17042015-135749 |
| Date | 03 November 2014 |
| Creators | Balico, Laís de Lourdes de Lima |
| Contributors | Uyemura, Sergio Akira |
| Publisher | Biblioteca Digitais de Teses e Dissertações da USP |
| Source Sets | Universidade de São Paulo |
| Language | Portuguese |
| Detected Language | English |
| Type | Dissertação de Mestrado |
| Format | application/pdf |
| Rights | Liberar o conteúdo para acesso público. |
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