Das Thema dieser Arbeit ist die Sensitivitätserhöhung der Kernspinmagnetresonanzspektroskopie (NMR-Spektroskopie) für die Anwendung an biologischen Systemen durch dynamische Kernspinpolarisation (DNP). Dementsprechend wurden die experimentellen Bedingungen möglichst ähnlich zu einer physiologischen Umgebung in Lösung gewählt. Unter diesen Voraussetzungen ist der Overhauser-Effekt der zentrale Mechanismus für DNP. Dieser ist von der relativen Diffusion zwischen den Kernspins des Zielmoleküls und dem polarisierenden Molekül, welchesein ungepaartes Elektron aufweist, abhängig. Als experimenteller Ansatz für diese Arbeit wurde ein Shuttle-DNP-Spektrometer mit Proben im flüssigen Zustand ausgewählt. Hierbei wurden die Kernspins bei einem Magnetfeld von 0,34 T polarisiert und für eine hoch auflösende NMR-Detektion in ein Magnetfeld von 14,09 T transferiert. Mehrere technische Anpassungen, welche zu einer Erhöhung der Stabilität und Reproduzierbarkeit der Messungen führten, wurden sukzessiv implementiert. Für die Signale der Protonen von L-Tryptophan wurde im Hochfeld eine DNP-Verstärkung εhf von bis zu -2,4 (H<sup>η2</sup>) gemessen. Darauf aufbauend wurde ein allgemeiner Verstärkungsfaktor εglobal eingeführt. Dieser beinhaltete sowohl die Vorteile des Shuttle-DNP-Spektrometers, wie beispielsweise die schnellere Aufnahmerate der DNP-Experimente als auch die Nachteile, wie etwa die Linienverbreiterung der Signale durch die Gegenwart des polarisierenden Radikals. Anschließend wurde dieser Faktor schrittweise auf eindimensionale Messungen angewandt und an diese
angepasst. Hierfür wurden die Aufbaurate der Polarisation und die Aufnahmezeit der Messungen mit DNP und Boltzmann-Polarisation optimiert, um das maximale Signal-zu-Rauschen-Verhältnis pro Messzeit zu erhalten. Diese Parameter basieren auf T1 bzw. T2∗. Das Ergebnis dieser Schritte war ein angewandter, allgemeiner Verstärkungsfaktor εapp von -4.0 für Hδ1 von L-Tryptophan. Des Weiteren wurden die Kernspineigenschaften von Protonen für DNP, wie z.B.die Relaxationsraten, gemessen und miteinander verglichen. Der daraus abgeleitete Kopplungsfaktor implizierte, dass die intermolekulare, dipolare Wechselwirkung zwischen den Kernspins des Zielmoleküls und dem Elektron des polarisierenden Radikals von der räumlichen Zugänglichkeit der Kernspins beeinflusst wurde. Zudem wurde gezeigt, dass diese Wechselwirkung am besten durch ein Model basierend auf translatorischer Diffusion beschrieben werden konnte. Mit diesem wurde der Abstand der dichtesten Annährung zwischen den Kernspins und dem ungepaartem Elektron bestimmt. Diese Abstände reichen entsprechend der Zugänglichkeit des jeweiligen Protons von 3 bis 5 Å. Darauf aufbauend wurden die DNP-Verstärkungen für Kohlenstoff gemessen. Für deuteriertes L-Tryptophan-d8,15N2,13C11 wurden Verstärkungen zwischen -0,3 und -2,5 erzielt. Durch weitere Berechnungen wurde gezeigt, dass diese Verstärkungen mit den zuvor berechneten Abständen der dichtesten Annäherung der Protonen übereinstimmten und dadurch den Ansatz des Models der translatorischen Diffusion untermauerten. In weiteren Messungen an protoniertem L-Tryptophan-15N2,13C11 wurde der Drei-Spin-Effekt erstmalig bei einem gelösten Molekül beobachtet. Dieser Effekt basierte auf der dipolaren Wechselwirkung zwischen den Spins der Protonen, Kohlenstoffkerne und Radikal-Elektronen. Er verursachte positive Signalverstärkungen von bis zu 2,3 für alle Kohlenstoffe außer dem Carbonyl-Kohlenstoff, welcher eine Signalverstärkung von -2,5 aufwies. Diese Ergebnisse waren in Übereinstimmung mit einem erweiterten Kopplungsfaktor, der die intramolekulare Wechselwirkung zwischen Kohlenstoff und Proton neben der zwischen Kohlenstoff und Elektron berücksichtigte. In einem abschließenden Schritt wurden DNP-Experimente an einem Protein (Ubiquitin-U-15N,U-13C) durchgeführt. Zu diesem Zweck wurden zweidimensionale Shuttle-DNP-1H-13C-HSQC-Spektren aufgenommen. Zum ersten Mal konnte ein DNP-Transfer zu der Oberfläche eines Proteins in Lösung nachgewiesen werden.
| Identifer | oai:union.ndltd.org:uni-goettingen.de/oai:ediss.uni-goettingen.de:11858/00-1735-0000-0022-5E86-1 |
| Date | 28 January 2014 |
| Creators | Lottmann, Philip |
| Contributors | Griesinger, Christian Prof. Dr. |
| Source Sets | Georg-August-Universität Göttingen |
| Language | English |
| Detected Language | German |
| Type | doctoralThesis |
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