Genetisch kodierte Photorezeptoren in Modellorganismen begründen die Optogenetik. Sie ermöglicht die nicht-invasive, reversible und räumlich-zeitlich präzise Perturbation von zellulären und physiologischen Signalprozessen durch Licht. Natürliche photoaktivierte Adenylylzyklasen (PACs) steigern die intrazelluläre Konzentration des Botenstoffs zyklischen Adenosinmonophosphats (cAMP) durch Blaulicht. Damit erlauben sie die optogenetische Analyse von cAMP-abhängigen Signalwegen. Diese Arbeit komplementiert PACs durch die synthetische rotlichtaktivierte Phosphodiesterase LAPD zur Degradation von cAMP und zyklischem Guanosinmonophosphat (cGMP). LAPD ist eine Chimäre aus dem photosensorischen Modul von Deinococcus radiodurans Bakteriophytochrom (DrBPhy) und der Effektordomäne der cAMP/cGMP-spezifischen H. sapiens Phosphodiesterase 2A (HsPDE2A). Die Fusionsstelle wurde von den helikalen Linkern zwischen Sensor- und Effektormodulen durch strukturelle Überlagerung abgeleitet. LAPD inkorporierte den Chromophor Biliverdin (BV) nach Expression in E. coli und Reinigung vollständig und entsprach spektral und photochemisch dem Wildtyp-DrBPhy. Durch Bestrahlung mit Rot- und Fernrotlicht (R bzw. FR) wurde LAPD in die metastabilen photochemischen Zustände Pfr (fernrot) bzw. Pr (rot) umgewandelt. Vollständig aktivierte LAPD katalysierte die Hydrolyse von cGMP und cAMP in derselben Größenordnung wie Wildtyp-HsPDE2A. LAPD degradierte cGMP und cAMP bei 6- bzw. 4-facher Steigerung von vmax unter R im Vergleich zu dunkeladaptiertem Enzym. Die Aktivität von R-adaptierter LAPD wurde durch FR reduziert. Die enzymatische Aktivität und Lichtregulation von LAPD-Linkervarianten waren abhängig von der Linkerlänge. LAPD degradierte lichtabhängig cGMP in einer PDE-Reporterzelle. Dabei genügte die endogene BV-Konzentration der Säugerzelle zur Sättigung des Lichteffekts. / Genetically encoded photoreceptors in model organisms establish optogenetics. It enables non-invasive, reversible, and spatio-temporally precise perturbation of cellular and physiological signalling by light. Natural photoactivated adenylate cyclases (PACs) increase the intracellular concentration of the second messenger cyclic adenosine monophosphate (cAMP) under blue light. Hence, PACs allow the optogenetic analysis of cAMP-dependent signalling. This work complements PACs with the synthetic red-light-activated phosphodiesterase LAPD for degradation of cAMP and cyclic guanosine monophosphate (cGMP). LAPD is a chimera made up of the photosensory module of Deinococcus radiodurans bacteriophytochrome (DrBPhy) and the effector domain of cAMP/cGMP-specific H. sapiens Phosphodiesterase 2A (HsPDE2A). The fusion site was derived from the helical linkers between sensor and effector modules via structural superposition. LAPD incorporated the chromophor biliverdin (BV) after expression in E. coli and purification quantitatively, and spectrally and photochemically resembled the wildtype DrBPhy. Upon irradiation with red and far-red light (R and FR, resp.), LAPD was converted to the metastable photochemical states Pfr (far-red) and Pr (red), respectively. Fully activated LAPD catalized the hydrolysis of cGMP and cAMP with rates similar to wildtype HsPDE2A. LAPD degraded cGMP and cAMP with 6- and 4-fold increase of vmax under R, respectively, as compared to the dark state. The activity of R-adapted LAPD was reduced upon irradiation with FR. Enzymatic activity and light regulation of LAPD linker variants depended on the linker length. LAPD light-dependently degraded cGMP in a PDE reporter cell line. Endogenous BV concentrations were sufficient to saturate the light effect in the mammalian cell, which enables a true optogenetic approach.
| Identifer | oai:union.ndltd.org:HUMBOLT/oai:edoc.hu-berlin.de:18452/18026 |
| Date | 03 December 2015 |
| Creators | Gasser, Carlos Fernando |
| Contributors | Möglich, Andreas, Hegemann, Peter, Gärtner, Wolfgang |
| Publisher | Humboldt-Universität zu Berlin, Lebenswissenschaftliche Fakultät |
| Source Sets | Humboldt University of Berlin |
| Language | German |
| Detected Language | English |
| Type | doctoralThesis, doc-type:doctoralThesis |
| Format | application/pdf |
| Rights | Namensnennung - Keine kommerzielle Nutzung - Keine Bearbeitung, http://creativecommons.org/licenses/by-nc-nd/3.0/de/ |
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