In mono- und eudikotylen Pflanzen kodiert eine Genfamilie (RpoT, RNA-Polymerase des T3/T7-Typs) mitochondriale und plastidäre RNA-Polymerasen (RNAP), die den ungeraden T-Phagen-Polymerasen ähneln. RpoT-Gene von Angiospermen sind gut charakterisiert, während aus tiefer abzweigenden Pflanzenspecies bisher lediglich die Gene aus dem Moos Physcomitrella beschrieben wurden. Um einen Beitrag zur Aufklärung der molekularen Evolution der RpoT-Polymerasen im Pflanzenreich zu liefern und um Erkenntnisse über die potentielle Bedeutung von multiplen Phagen-Typ (RNAP) in Pflanzen zu gewinnen, wurden die RpoT-Gene aus dem Lycophyten Selaginella moellendorffii und aus dem basalen Angiosperm Nuphar advena identifiziert und charakterisiert. Selaginella moellendorffii (Moosfarn)-Trace-Sequenzdaten mit hoher Ähnlichkeit zu RpoT-Sequenzen von Angiospermen wurden benutzt, um das full-length SmRpoT-Gen und die entsprechende cDNA zu isolieren. Die SmRpoT-mRNA ist 3542 nt lang und weist einen offenen Leserahmen von 3006 nt auf, der für ein putatives Protein aus 1002 Aminosäuren mit einer molekularen Masse von 113 kDa kodiert. Das SmRpoT-Gen besteht aus 19 Exons und 18 Introns, die in ihren Positionen mit denen aus den Angiosperm- und Physcomitrella-Genen konserviert sind. Mittels Southernblot-Analyse wurde nachgewiesen, dass S. moellendorffii ein single-copy RpoT-Gen kodiert. Für das N-terminale Transitpeptid von SmRpoT konnte gezeigt werden, dass es bei transienter Expression in Arabidopsis- und Selaginella-Protoplasten den Transport von GFP (green fluorescent protein) exclusiv in Mitochondrien vermittelt. In N. advena wurden mittels Screening einer BAC-Bibliothek drei RpoT-Gene identifiziert. Sowohl die genomischen als auch die cDNA-Sequenzen wurden aufgeklärt. Die NaRpoT-mRNAs kodieren putative Polypeptide von 996, 990 und 985 Aminosären. Alle drei Gene besitzen 19 Exons und 18 Introns, die in ihren Positionen mit denen der RpoT-Gene aus Selaginella und allen anderen Landpflanzen konserviert sind. Die kodierten Proteine weisen auf Aminosäureebene einen hohen Konservierungsgrad auf, einschließlich aller essentiellen Regionen und Aminosäurereste, die für die T7-RNAP bekannt sind. Die N-terminalen Transitpeptide zweier der kodierten RNAP, NaRpoTm1 und NaRpoTm2, vermittelten den Import von GFP exclusiv in Mitochondrien, während die dritte Polymerase, NaRpoTp, in Chloroplasten importiert wurde. Interessanterweise muß die Translation der NaRpoTp-mRNA an einem CUG-Codon initiiert werden, um ein funktionelles Protein mit plastidärem Transitpeptid zu erhalten. Die N. advena RpoTp-RNAP ist somit neben AGAMOUS aus Arabidopsis und der RpoTp-RNAP aus Nicotiana, ein weiteres Beispiel für jene selten vorkommenden pflanzlichen mRNAs, deren Translation exclusiv an nicht-AUG-Codons initiiert wird. Die Rekonstruktion von phylogenetischen Bäumen resultierte in unterschiedlichen Positionen für die Selaginella- und Nuphar-Polymerasen: Im Gegensatz zu der RpoT-Polymerase aus S. moellendorffii und denen aus Physcomitrella, die in den phylogenetischen Analysen Schwesterpositionen zu allen anderen Phagentyp-RNAP der Angiospermen einnehmen, clusterten die Nuphar-RpoTs zusammen mit den deutlich separierten mitochondrialen (NaRpoTm1 und NaRpoTm2) und plastidären (NaRpoTp) Polymerasen. Selaginella kodiert eine einzige mitochondriale RNAP, während Nuphar zwei mitochondriale und eine plastidäre RNAP besitzt. Die Identifizierung einer Plastiden-lokalisierten Phagentyp-RNAP in diesem basalen Eudikotylen, die ortholog zu allen anderen RpoT-Enzymen der Blütenpflanzen ist, läßt darauf schließen, daß die Acquisition einer nukleär kodierten plastidären RNAP, die noch in den Lycopoden fehlt, nach der Trennung der Leucopoden von allen anderen Tracheophyten erfolgte. Eine “dual-targeting” RNAP (mitochondrial und plastidär lokalisiert), wie sie in Eudikotylen, nicht jedoch in Monokotylen vorkommt, wurde weder in Selaginella noch in Nuphar nachgewiesen, vermutlich ist sie ein evolutionäres Novum von eudikotylen Pflanzen wie Arabidopsis. / In mono- and eudicot plants, a small nuclear gene family (RpoT, RNA polymerase of the T3/T7 type) encodes mitochondrial as well as chloroplast RNA polymerases homologous to the T-odd bacteriophage enzymes. RpoT genes from angiosperms are well characterized, whereas data from deeper branching plant species until recently were limited to the moss Physcomitrella. To elucidate the molecular evolution of the RpoT polymerases in the plant kingdom and to get more insight into the potential importance of having more than one phage-type RNA polymerase (RNAP) available, we identified and characterized RpoT genes in the lycophyte Selaginella moellendorffii and the basal eudicot Nuphar advena. Selaginella moellendorffii (spikemoss) sequence trace data encoding a polypeptide highly similar to angiosperm and moss phage-type organelle RNA polymerases were used to isolate a BAC clone containing the full-length gene SmRpoT as well as the corresponding cDNA. The SmRpoT mRNA comprises 3452 nt with an open reading frame of 3,006 nt, encoding a putative protein of 1,002 amino acids with a molecular mass of 113 kDa. The SmRpoT gene comprises 19 exons and 18 introns, conserved in their position with those of the angiosperm and Physcomitrella RpoT genes. Using Southern blot analysis, it was shown that S. moellendorffii encodes a single RpoT gene. The N-terminal transit peptide of SmRpoT was shown to confer targeting of green fluorescent protein (GFP) exclusively to mitochondria after transient expression in Arabidopsis and Selaginella protoplasts. In Nuphar advena three RpoT genes were identified by BAC library screening. Both genomic gene sequences and full-length cDNAs were determined. The NaRpoT mRNAs specify putative polypeptides of 996, 990 and 985 amino acids, respectively. All three genes comprise 19 exons and 18 introns, conserved in their positions with those from S. moellendorffii and the RpoT genes of other land plants. The encoded proteins show a high degree of conservation at the amino acid sequence level, including all functional crucial regions and residues known from the phage T7 RNAP. The N-terminal transit peptides of two of the encoded polymerases, NaRpoTm1 and NaRpoTm2, conferred targeting of GFP exclusively to mitochondria, whereas the third polymerase, NaRpoTp, was targeted to chloroplasts. Remarkably, translation of NaRpoTp mRNA has to be initiated at a CUG codon to generate a functional plastid transit peptide. Thus, besides AGAMOUS in Arabidopsis and the Nicotiana RpoTp polymerase, N. advena RpoTp provides another example for a plant mRNA that is exclusively translated from a non-AUG codon. Reconstruction of phylogenetic trees revealed different positions of the RpoTs from the lycophyte Selaginella and the basal eudicot Nuphar. In contrast to the RpoTs of S. moellendorffii and those of the moss Physcomitrella, which are according to the phylogenetic analyses in sister positions to all other phage-type polymerases of angiosperms, the Nuphar RpoTs clustered with the well separated clades of mitochondrial (NaRpoTm1 and NaRpoTm2) and plastid (NaRpoTp) polymerases. Selaginella encodes a single mitochondrial RNAP, whereas Nuphar harbors two mitochondrial and one plastid phage-type polymerases. Identification of a plastid localized phage-type RNAP in this basal eudicot, orthologous to all other RpoTp enzymes of flowering plants, suggests that the acquisition of a nuclear encoded plastid RNA polymerase, not present in lycopods, took place after the split of lycopods from all other tracheophytes. A dual-targeted mitochondrial and plastid RNA polymerase (RpoTmp), as present in eudicots but not monocots, was not detected in Nuphar or Selaginella suggesting that its occurrence is an evolutionary novelty of eudicotyledoneous plants like Arabidopsis.
| Identifer | oai:union.ndltd.org:HUMBOLT/oai:edoc.hu-berlin.de:18452/16922 |
| Date | 14 February 2011 |
| Creators | Yin, Chang |
| Contributors | Börner, Thomas, Knoop, Volker, Schuster, Wolfgang |
| Publisher | Humboldt-Universität zu Berlin, Mathematisch-Naturwissenschaftliche Fakultät I |
| Source Sets | Humboldt University of Berlin |
| Language | English |
| Detected Language | English |
| Type | doctoralThesis, doc-type:doctoralThesis |
| Format | application/pdf, application/octet-stream, application/octet-stream |
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