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Previous issue date: 2010 / Fundação Oswaldo Cruz. Instituto Oswaldo Cruz. Rio de Janeiro, RJ, Brasil. / O interesse da literatura científica pela imunoglobulina Y (IgY) é crescente devido a
várias vantagens tais como: fácil obtenção, baixo custo, produção em larga escala e
método mais adequado quanto ao aspecto bioético. A IgY esta presente em aves e
répteis, sendo transferida do soro para a gema dos ovos desses animais através de
processo secretório. A produção de imunoglobulina IgY específica contra o vírus da
hepatite A se justifica na detecção do vírus da Hepatite A (HAV) em tecido hepático
em casos de hepatite fulminante sem diagnóstico definido, em ensaios
experimentais para preparação de novas vacinas para hepatite A e a possibilidade
de emprego como imunoterapia na prevenção da hepatite aguda pós-exposição ao
vírus. Cabe ressaltar que anticorpos anti-HAV atualmente comercializados têm baixa
afinidade e têm custo elevado. Nosso estudo consistiu em produzir anticorpos
específicos anti-HAV em frangas ISA Brown imunizadas e avaliar seu uso no
diagnóstico da hepatite A em tecido. METODOLOGIA: Vinte galinhas divididas em
cinco grupos (I-V) foram imunizadas com os seguintes inóculos: Grupo I – Vacina
comercial contra hepatite A e Oligodesoxinucleotídeos contendo C-fosfato-
guanosina (CpG-ODN); Grupo II – Vacina comercial contra hepatite A; Grupo III –
Vírus da Hepatite A, adjuvante incompleto de Freund (IFA) e CpG-ODN; Grupo IV –
Vírus da Hepatite A e IFA; Grupo V – IFA (controle). Os ovos foram coletados e
purificados pelo método de precipitação em polietileno glicol (PEG). A IgY foi
caracterizada e quantificada pelos métodos de ELISA, neutralização in vitro,
eletroforese e “Western Blotting”. A detecção do HAV em fígado foi realizada pelo
método de imunofluorescência indireta (IIF) com a IgY anti-HAV sendo utilizada
como anticorpo primário e IgG de cabra anti-IgY marcada com Alexa Fluor® 488
como anticorpo secundário. Para isto utilizamos amostras de fígado de primatas
não-humanos (macacos cynomolgus) infectados e não infectados com HAV, uma
amostra humana com hepatite fulminante de etiologia viral por hepatite A e uma
amostra humana com hepatite fulminante de etiologia não viral (controle). Os
anticorpos primários (IgY) utilizados foram purificados dos ovos dos grupos I e III, e o
anticorpo do Grupo V foi utilizado como controle. RESULTADOS E DISCUSSÃO:
Todas as aves imunizadas com antígeno HAV soro-converteram, e os anticorpos IgY
anti-HAV foram efetivamente transferidos para a gema dos ovos tendo a associação
dos adjuvantes IFA mais CPG-ODN se mostrado mais efetiva. Os métodos de
caracterização da IgY demonstraram especificidade ao antígeno HAV, contudo o
diagnóstico tecidual pela técnica da IIF apresentou excessiva marcação inespecífica,
necessitando de aprimoramento na técnica de purificação da imunoglobulina para
uso nesta finalidade. / Immunoglobulin Y (IgY) is found in birds and reptiles, currently used by the
advantage of being transported from serum to the yolk of eggs of these animals. This
protein is purified from egg yolk of immunized birds with a specific antigen, and the
IgY easily accessible and has bioethical character, because the animals do not suffer
any injury. Besides low cost, the amount of immunoglobulin produced by animals is
very high, accounting for five to ten times the average annual production of IgG in
rabbits. Moreover, the conserved mammalian proteins are often more immunogenic
in birds than in mammals. Detection of Hepatitis A Virus (HAV) in liver tissue is
important in cases of acute liver failure to precisely diagnose the cause of liver
failure, in clinical trials to test a new vaccine for hepatitis A, and the possibility of
employment as immunotherapy in the prevention of acute hepatitis after exposure to
the virus. The anti-HAV antibodies currently marketed have low affinity and have high
cost. Our study aims to produce specific anti-HAV in laying hens immunized for
detection of HAV in liver. METHODS: Twenty chickens divided into five groups (I-V)
were immunized with the following schedule: Group I - commercial vaccine against
hepatitis A and C-phosphate-guanosine-oligodeoxynucleotide (CpG-ODN); Group II -
commercial vaccine against hepatitis A; Group III - HAV, Freund's incomplete
adjuvant (IFA) and CpG-ODN; Group IV - HAV and IFA; Group V - IFA (control). The
eggs were collected and purified by the method of precipitation in polyethylene glycol
(PEG). The IgY was characterized and quantified by ELISA, neutralization,
electrophoresis and Western blotting. The detection of HAV in liver were analyzed by
indirect immunofluorescence (IIF) with IgY anti-HAV was used as primary antibody
and goat IgG anti-IgY labeled with Alexa Fluor® 488 as secondary antibody. We used
samples of liver non-human primates (cynomolgus monkeys) infected and not
infected with HAV, a human sample with fulminant hepatitis of viral hepatitis A and a
human sample with fulminant hepatitis without viral etiology (control). The primary
antibodies (IgY) used were purified from eggs of groups I and III, and the antibody of
the Group V was used as control. RESULTS AND DISCUSSION: All immunized
chickens were seroconvert, except the birds in the control group, and the protein
purified from egg yolk IgY was the anti-HAV. All tissue sections showed staining with
IgY anti-HAV independent of the liver is infected or not, while control IgY did not
show labeling. In all immunofluorescence was background. The IgY group I had
better results than group III, having less unspecific binding. These results
demonstrate that the antibody produced is really specific for hepatitis A virus and
after that the technique can be standardized, it can be used for the
immunofluorescence detection of the virus in sections of liver.
| Identifer | oai:union.ndltd.org:IBICT/oai:www.arca.fiocruz.br:icict/4155 |
| Date | January 2010 |
| Creators | Vasconcelos, Gentil Arthur Lins Bentes Mendonça de |
| Contributors | Machado, Marcelo Pelajo, Moraes e Souza, Marcia Terezinha Baroni de, Paixão, Izabel Christina Nunes de Palmer, Pinto, Marcelo Alves |
| Source Sets | IBICT Brazilian ETDs |
| Language | Portuguese |
| Detected Language | English |
| Type | info:eu-repo/semantics/publishedVersion, info:eu-repo/semantics/masterThesis |
| Source | reponame:Repositório Institucional da FIOCRUZ, instname:Fundação Oswaldo Cruz, instacron:FIOCRUZ |
| Rights | Gentil Arthur Lins Bentes Mendonça de Vasconcelos, info:eu-repo/semantics/openAccess |
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