Conselho Nacional de Desenvolvimento CientÃfico e TecnolÃgico / A cÃrie precoce da infÃncia (CPI) à caracterizada pela presenÃa de uma ou mais lesÃes em superfÃcie dentÃria de crianÃas menores de 6 anos de idade, sendo considerada um problema de saÃde pÃblica. Streptococcus mutans (SM) à considerado o principal agente etiolÃgico da doenÃa e possui vÃrios atributos de virulÃncia que permitem sua sobrevivÃncia na cavidade oral e, portanto, sua seleÃÃo em situaÃÃes de estresse nesse ambiente. Neste contexto, este trabalho teve por objetivos: (a) padronizar um mÃtodo de extraÃÃo e purificaÃÃo de RNA total para viabilizar estudos de expressÃo gÃnica bacteriana de lesÃes de cÃrie dentinÃria in vivo (capÃtulo 1); (b) identificar e quantificar SM metabolicamente ativo e analisar a expressÃo dos genes de virulÃncia atpD, fabM, nox, pdhA e aguD em lesÃes dentinÃrias ativas e inativas (capÃtulo 2). Foi realizada a coleta de 29 amostras de dentina cariada ativa e de 16 amostras de lesÃes dentinÃrias inativas de crianÃas com CPI. As amostras foram submetidas à extraÃÃo e purificaÃÃo do RNA total por um mÃtodo padronizado, com base no uso de lise mecÃnica e kit de extraÃÃo comercial e, em seguida, submetidas Ãs reaÃÃes de transcriÃÃo reversa (RT) para obtenÃÃo do DNA complementar (cDNA). Com o intuito de comprovaÃÃo da especificidade dos primers para os genes de virulÃncia de SM em amostras in vivo, 06 amostras de cDNA foram amplificadas e submetidas ao sequenciamento de Sanger para cada primer. ApÃs verificaÃÃo da especificidade, reaÃÃes em cadeia da polimerase quantitativa em tempo real da transcriÃÃo reversa (RT-qPCR) foram executadas para todas as amostras. Os resultados obtidos mostraram que o RNA bacteriano pÃde ser extraÃdo em adequada quantidade e qualidade pelo protocolo padronizado, viabilizando seu uso em estudos de expressÃo de genes bacterianos em dentina cariada (CapÃtulo 01). Os resultados da RT-qPCR mostraram que, apesar da baixa quantificaÃÃo em relaÃÃo aos estreptococos e bactÃrias totais, SM viÃveis foram detectados com quantificaÃÃo semelhante em lesÃes ativas e inativas (p>0.05). Apesar disso, maior expressÃo dos genes de virulÃncia pdhA e aguD foi detectada nas lesÃes inativas (p≤0,05) (CapÃtulo 02). Concluiu-se que, apÃs padronizaÃÃo de uma tÃcnica eficaz de extraÃÃo de RNA, reaÃÃes de RT-qPCR foram executadas com eficiÃncia para identificaÃÃo, quantificaÃÃo e expressÃo gÃnica de SM em amostras de dentina humana cariada. SM estavam viÃveis nos dois grupos de lesÃes, porÃm sà nas lesÃes dentinÃrias inativas mostraram maior expressÃo dos genes pdhA e aguD, provavelmente para viabilizar sua atividade metabÃlica nas condiÃÃes menos favorÃveis à sua sobrevivÃncia, inerentes a este substrato. / Early childhood caries (ECC) is characterized by the presence of one or more lesions on dental surface of children under 6 years old, being considered a public health issue. Streptococcus mutans (SM) is considered the main etiologic agent of the disease and has several virulence features that allow its survival in the oral cavity and, therefore, its selection under environmental stress situations. In this context, this research had as objectives; (a) to describe a method of total RNA extraction and purification to conduct studies on bacterial gene expression from in vivo dentine caries lesions (Chapter 01); (b) to identify and quantify the metabolically active SM and analyze the expression of its virulence genes atpD, fabM, nox, pdhA and aguD on active and arrested dentin lesions (Chapter 02). Twenty-nine samples of active dentin caries and 16 samples of arrested dentin lesions were collected from children with ECC. The samples were submitted to extraction and purification of total RNA through a customized method, based on the use of a mechanical lysis and a commercial extraction kit and submitted to reverse transcriptase (RT) reaction to obtain complementary DNA (cDNA). Next, to demonstrate the primers specificity for the virulence genes on in vivo samples, 06 cDNA samples were submitted to Sangerâs sequencing for each primer. After verifying the specificity, RT-qPCR (quantitative real-time reverse transcription polymerase chain reaction) were executed for all the samples. The results showed that the bacterial RNA could be extracted in appropriate quantity and quality through the customized protocol, making its use on gene expression studies on dentin affected by caries (Chapter 01). The RT-qPCR results showed that, despite the low quantification, if compared to total streptococci and total bacteria, SM was detected as metabolically active with similar quantification on active and arrested lesions (p>0.05). Despite that, a higher expression of the virulence genes pdhA and aguD was detected on arrested lesions (p≤0,05) (Chapter 02). It was concluded that after standardization of an effective RNA extraction technique, reactions of RT-qPCR were efficiently executed for SM identification, quantification, and gene expression on samples of human dentin affected by caries. This bacterium proved to be viable, however, only inactive lesions showed larger expression of the genes pdhA and aguD, probably to make its metabolic activity viable, even in unfavorable survival conditions.
| Identifer | oai:union.ndltd.org:IBICT/oai:www.teses.ufc.br:8832 |
| Date | 17 November 2014 |
| Creators | Daniela da Silva Bezerra |
| Contributors | Lidiany Karla Azevedo Rodrigues, Nadia Accioly Pinto Nogueira, Marlise InÃs Klein, Maria Izabel Florindo Guedes, Rodrigo Maranguape Silva da Cunha |
| Publisher | Universidade Federal do CearÃ, Programa de PÃs-GraduaÃÃo em Odontologia, UFC, BR |
| Source Sets | IBICT Brazilian ETDs |
| Language | Portuguese |
| Detected Language | English |
| Type | info:eu-repo/semantics/publishedVersion, info:eu-repo/semantics/doctoralThesis |
| Format | application/pdf |
| Source | reponame:Biblioteca Digital de Teses e Dissertações da UFC, instname:Universidade Federal do Ceará, instacron:UFC |
| Rights | info:eu-repo/semantics/openAccess |
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