A produção de proteínas recombinantes é uma ferramenta essencial para a indústria biotecnológica e suporta a expansão da pesquisa biológica moderna. Uma variedade de hospedeiros pode ser utilizada para produzir estas proteínas e dentre eles, as bactérias E. coli são as hospedeiras mais utilizadas. No entanto, a expressão heteróloga de genes em E. coli frequentemente resulta em um processo de enovelamento incompleto que leva ao acúmulo de agregados insolúveis, conhecidos como corpos de inclusão (CI). Altas pressões hidrostáticas são capazes de desfavorecer interações intermoleculares hidrofóbicas e eletrostáticas, levando à dissociação dos agregados e por isso são úteis para solubilizar e renaturar proteínas agregadas em CI. O presente trabalho teve como objetivo o estudo do processo de desagregação dos CI e de renaturação das proteínas oligoméricas subunidade B da toxina colérica (CTB) e região globular da fibra adenoviral (RGFA) utilizando altas pressões hidrostáticas. A toxina colérica (CT) é composta por uma subunidade A e cinco subunidades B combinadas em uma holotoxina AB5. A CTB é a porção pentamérica não tóxica da CT, responsável pela ligação da holotoxina ao receptor gangliosídeo GM1. A fibra do adenovírus é uma proteína homotrimérica que forma parte do capsídeo viral, organizada em três regiões: a cauda N-terminal, a haste central e a região C-terminal (região globular). A RGFA se liga à proteína de membrana CAR nas células hospedeiras e promove a internalização do vírus. Os estudos apresentados neste trabalho demonstraram que a alta pressão hidrostática foi eficaz na desagregação dos CI da CTB e da RGFA. As condições de renaturação foram otimizadas utilizando-se diferentes proporções do par redox glutationa oxidada e reduzida, concentrações de agentes caotrópicos, presença de aditivos e esquemas diferenciados de compressão/descompressão daqueles previamente descritos na literatura. CTB solúvel e pentamérica foi obtida pela compressão da suspensão de CI a 2,4 kbar por 16 horas em tampão TrisHCl 50 mM pH 8,5, 1 mM de tween 20 e descompressão direta seguida de incubação em pressão atmosférica. O rendimento de renaturação da CTB solúvel e pentamérica foi de até 45 % e 288 mg de CTB/litro de cultura bacteriana. Esta proteína apresentou estrutura regular e atividade biológica. RGFA trimérica foi obtida pela compressão da suspensão de CI em tampão TrisHCl 50 mM pH 8,0 e 0,5 M de L-arginina a 2,4 kbar por 1,5 horas e 0,4 kbar por 16 horas antes da completa descompressão. O rendimento de proteína solúvel trimérica da RGFA foi de 4 %, porém não foi possível obter a atividade biológica desta proteína. / The production of recombinant proteins is an essential tool for the biotechnology industry and supports the expansion of modern biological research. Recombinant proteins can be produced by a variety of hosts and among them the bacteria E. coli is the most commonly used. However, the expression of heterologous genes in E. coli often results in an incomplete folding process that leads to the accumulation of insoluble aggregates known as inclusion bodies (IB). The application of high hydrostatic pressure impairs intermolecular hydrophobic and electrostatic interactions of proteins in solution, leading to dissociation of aggregates and is therefore useful tool to solubilize and refold aggregated proteins in IB. This work aimed to study the process of disaggregation of IB and refolding of oligomeric proteins the B subunit of cholera toxin (CTB) and the globular region of the adenoviral fiber (RGFA) using high hydrostatic pressure. The cholera toxin (CT) comprises one A subunit and five B subunits, combined in the AB5 holotoxin. The pentameric CTB is non-toxic moiety of CT which is responsible for binding to the receptor ganglioside GM1 holotoxin. The adenovirus fiber is a homotrimeric protein wich forms part of the viral capsid and it is organized into three regions: the N-terminal tail, the central rod and the C-terminal region (globular region). The RGFA binds to membrane protein CAR in host cells and promotes the internalization of virus. The studies presented here demonstrate that high hydrostatic pressure was effective in the disaggregation of the CTB and RGFA IB. The refolding conditions were optimized using different proportions of the redox couple oxidated and reduced glutathione, concentrations of chaotropic agents, presence of additives and pressure/decompression schemes distinguished from the previously described in the literature. Soluble pentameric CTB was obtained when the suspension of IB were compressed at 2.4 kbar for 16 hours in 50 mM of Tris-HCl buffer pH 8.5, 1 mM of tween 20, followed by direct decompression and incubation at atmospheric pressure. The yield of refolded soluble pentameric CTB was up to 45 % and 288 mg of CTB/ liter of bacterial culture. This protein was shown to presented regular structure and biological activity. Trimeric RGFA was obtained by compression of the suspension of IB in 50 mM of Tris-HCl buffer pH 8.0, 0.5M L-arginine at 2.4 kbar for 1.5 hours and at 0.4 kbar for 16 hours prior to the complete decompression. The yield of soluble trimeric RGFA was 4 %, however this protein did not present biological activity.
| Identifer | oai:union.ndltd.org:usp.br/oai:teses.usp.br:tde-06032013-144803 |
| Date | 24 September 2012 |
| Creators | Rodrigues, Daniella |
| Contributors | Dias, Ligia Ely Morganti Ferreira |
| Publisher | Biblioteca Digitais de Teses e Dissertações da USP |
| Source Sets | Universidade de São Paulo |
| Language | Portuguese |
| Detected Language | Portuguese |
| Type | Dissertação de Mestrado |
| Format | application/pdf |
| Rights | Liberar o conteúdo para acesso público. |
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